HPLC同时测定护肝片中5种成分的不确定度分析

伍国怡

【摘要】目的：建立HPLC法测定护肝片中腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的不确定度评定方法。方法：根据《测量不确定度评定与表示》的有关规定，分析影响含量结果不确定度的因素来源，并对各不确定度因素进行评定，计算合成不确定度，最终给出扩展不确定度和报告不确定度。结果：不确定度评估为腺苷±081%，五味子醇甲±086%，五味子酯甲±067%，五味子甲素±074%，五味子乙素±078%。结论：对照品的配制、样品溶液、进样重复性的不确定度是肝片5种成分不确定度的主要来源。

【关键词】HPLC；护肝片；腺苷；五味子醇甲；五味子酯甲；五味子甲素；五味子乙素；不确定度

【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）10-0033-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for uncertainty analysis of Adenosine、Schisandrin、Schisantherin、Deoxyschizandrin and Schisandrin B in Hugan Tabelts. Methods According to the technical requirements of Evaluation and expression of uncertainty in measurement， each active component of uncertainty was calculated the variable parameters among the procedures. The combined uncertainty and extended uncertainty reported Uncertainty were finally obtained by synthesized the uncertainties of various component variables. Results The uncertainty for Adenosine was±081%， Schisandrin was±086%， Schisantherin was±067%， Deoxyschizandrin was±074%and Schisandrin B was±078%. Conclusion The uncertainty of reference standard qualrity was the main source of five components measurement uncertainty in Hugan Tabelts.

Keywords：HPLC；Hugan Tabelts；Adenosine；Schisandrin；Schisantherin；Deoxyschizandrin；Schisandrin B； measurement uncertainty

护肝片由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆等六味中药经提取、加工制成的中成药，收载于2010年版《中国药典》一部[1]，具有疏肝理气，健脾消食，降低转氨酶的功效，临床用于慢性肝炎及早期肝硬化等。

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联系的参数[2]，它是被测量客观值在某一量值范围内的一个评定，其大小决定了测量结果的实用价值。测量不确定度是评价定量方法的可靠性与测量结果的可信程度的主要内容之一，其重要性已得到广泛认可。目前，测量不确定度的评定在环境分析、食品检验、药物分析等领域得到深入的研究和广泛的应用[3-8]。研究根据《测量不确定度评定与表示》（JJF1059-1999）中有关规定，对护肝片中5种成分含量的测量不确定度进行分析，以找出影响不确定度的因素，对不确定度进行评估，为评价检测报告提供理论依据，以控制测量结果的有效性和适宜性。

1仪器与材料

11仪器Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent 1200 LC色谱工作站、G1322A DEGASSER溶剂脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、 G1314B VWD 紫外检测器）；CP225D电子天平（德国赛多利斯 ）；COBOS AW-120自动电子天平（西班牙）；SB3200WS 超声波清洗器（上海必能信）；Type HT-203A column HEATER（天津市恒奥科技发展有限公司）。

12材料 腺苷（批号：110879-200202）、五味子醇甲（批号：110857-201412）、五味子酯甲（批号：111529-200302）、五味子甲素（批号：0764-200107）和五味子乙素（批号：110765-200407）对照品均购自中国药品生物制品检定所。护肝片（批号：20130512、20141122，黑龙江葵花药业股份有限公司；批号：20140702，广东省惠州市中药厂有限公司）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2方法与结果

21色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×46 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）07%磷酸溶液（B）梯度洗脱（见表1）；流速：08 ml/min；检测波长： 0～14min，260nm；1401～58min，250nm；柱温：30℃；进样量：10μl。理论板数按腺苷计应不低于2500。

22溶液的制备

221混合对照品溶液的制备分别精密称取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品1469、1980、989、1112、1138 mg置25ml量瓶，加50%甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成对照品贮备溶液；各精密取2ml置25ml量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度（含腺苷00470mg/ml、五味子醇甲00634mg/ml、五味子酯甲00316mg/ml、五味子甲素00356mg/ml、五味子乙素00364mg/ml的溶液）即得。

221供试品溶液的制备取本品10片，除去包衣后，精密称定，研细，取约1片的量，精密称定，精密加入50%甲醇20mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40KHz）50min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液用045μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

222阴性对照溶液的制备按处方中药味的比例，分别自配不含板蓝根和不含五味子的群药，按其工艺制成阴性对照样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

23方法学考察

231线性关系的考察精密称取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，以50%甲醇为溶剂，配制成混合对照品溶液。倍比稀释法配置成系列质量浓度的溶液。进样10μl，测定各组分峰面积。以各组分浓度（C）横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。腺苷：A=38133 C+13918，r=09998；五味子醇甲：A=20180 C+11309，r=10000；五味子酯甲：A=14253 C+59979，r=09999；五味子甲素：A=17825 C+38007，r=10000；五味子乙素：A=26780 C-15709，r=09999。

232精密度试验精密吸取同一供试品（批号：20130512）溶液10μl，按上述色谱条件进样，测定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积，重复进样6次，其RSD分别为085%、059%、105%、076%、081%。

233重复性试验取同一批样品（批号：20130512）约1片的量共6份，精密称定，分别制备供试品溶液，各进样10μl，测定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，结果RSD分别为：183%、139%、221%、179%、150%。

234稳定性试验取同一供试品（批号：20130512）溶液，分别在0、1、2、4、6、8、10、12h时进样10μl，记录色谱峰面积，计算腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积的RSD分别为152%、088%、191%、125%、095%。

235加样回收率试验精密量取已测定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素含量的护肝片（批号：20130512）样品9份（每份约05片的量），精密称定，每份分别精密加入一定量的腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品，制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果平均回收率分别为9945%、10010%、9919%、9969%、9988%。RSD分别为：159%、150%、178%、171%、150%。

3不确定度来源的识别及分析

31不确定度的来源从检测过程和数学模型分析，样品中5种成分含量的相对标准不确定度罸rel来源，主要包括：①对照品溶液浓度的相对标准不确定度Urel（Cs）；②供试品溶液配制过程引入相对标准不确定度Urel（V）；③HPLC测定峰面积相应值的相对标准不确定度Urel（A）、Urel（As）。即：

Urel=U2 rel （Cs） + U2 rel （V） + U2 rel （As） + U2 rel （A）

32对照品溶液浓度的相对标准不确定度Urel（Cs）：Urel（Cs）的来源：①对照片的纯度的不确定度；②对照品的称量所产生的相对不确定度Urel（ms）；③配制对照品溶液产生的相对不确定度Urel（Vs）。

321对照品的纯度的不确定度对照品腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均购自中国药品生物制品检定所，由于尚无法得到不确定度参考值，故此项忽略。

322对照品的称量所产生的相对不确定度Urel（ms） 检定证书中1/10万天平称量允差为001mg，按矩形分布计算不确定度为u（ms1）=001/3=00058mg；该天平称量时重复性标准偏差为001mg，即u（ms2）=001mg；腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素5种对照品的取样量分别为1469，1980，989，1112，1138mg，则对照品称量所引起的相对标准不确定度为：

腺苷：Urel（ms腺）=u（ms1）2+u（ms2）2m=000582+00121469=008%

同理五味子醇甲：Urel（ms醇）=006%；五味子酯甲：Urel（ms酯）=012%；五味子甲素：Urel（ms甲）=010%；五味子乙素：Urel（ms乙）=010%。

323对照品溶液配制的相对不确定度对照品溶液配制过程中分别使用了25ml量瓶与2ml移液管，其不确定度分别如下：①校准，A级25ml量瓶、2ml移液管的允许偏差分别为±003ml，±001ml，按矩形分布计算不确定度为003/3=00173ml，001/3=00058ml；②重复性，用A级25ml量瓶与2ml移液管重复吸量蒸馏水10次，测得重复性不确定度u（Vs25）=00034ml，u（Vs2）=00010ml；③温度，环境温度为室温（20±5）℃，溶剂水的体积膨胀系数为21×10-4，按矩形分布，环境温度引入的不确定度为u（Ts25）=（5×21×10-4×25）/3=00152℃，u（Ts2）=（5×21×10-4×2）/3=00012℃。

对照品溶液配制过程中分别使用了25ml量瓶2次，2ml移液管1次，因此对照品配制过程的引入的相对不确定度为：

Urel（Vs25）=001732+000342+00152225=009%

Urel（Vs2）=000582+000102+0001222=030%

Urel（Vs）=2×000092+000302=033%

因此，对照品溶液浓度引入的相对不确定度分别为：腺苷：Urel（Cs腺）=000082+000332=034%；同理五味子醇甲：Urel（Cs醇）=034%；五味子酯甲：Urel（Cs酯）=035%；五味子甲素：Urel（Cs甲）=035%；五味子乙素：Urel（Cs乙）=035%。

33供试品溶液配制过程中引入的相对标准不确定Urel（V）供试品溶液在配制过程中使用了20ml移液管，其不确定度如下：①校准，A级20ml移液管的允许偏差为±003ml，按矩形分布计算不确定度为003/3=00173ml；②重复性，用A级20ml移液管重复吸量蒸馏水10次，测得重复性不确定度u（Vs20）=00030ml；③温度，环境温度为室温（20±5）℃，溶剂水的体积膨胀系数为21×10-4，按矩形分布，环境温度引入的不确定度为u（Ts20）=（5×21×10-4×20）/3=00122℃。则样品溶液配制过程中引入的相对不确定度为：

Urel（V）=001732+000302+00122220=011%

34HPLC测定峰面积相应值的相对标准不确定度Urel（A），Urel（As）Urel（A），Urel（As）主要由重复进样引起，由仪器给出的进样峰面积标准偏差为随机测量，属A类不确定度。混合对照品溶液重复进样6次，其峰面积的标准不确定度按贝赛尔公式计算S=∑（Ai-A）2n-1，混合对照品中腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相对标准不确定度分别为Urel（AS腺）=S腺A腺=059%，Urel（AS醇）=S醇A醇=066%，Urel（AS酯）=S酯A酯=035%，Urel（AS甲）=S甲A甲=042%，Urel（AS乙）=S乙A乙=057%。

同理，供试品中5种成份的相对不确定度分别为Urel（A腺）=043%，Urel（A醇）=041%，Urel（A酯）=044%，Urel（A甲）=048%，Urel（A乙）=039%。

35计算合成不确定度将所有的不确定度分量进行汇总（表2），有利于更直观分析各分量的大小。对5种成分进行合成不确定度计算，结果分别为：

Urel腺=U2rel（CS腺）+U2rel（V）+U2rel（AS腺）+U2rel（A腺）

=000342+000112+000592+000432

=081%

同理：Urel醇=086%，Urel酯=067%，Urel甲=074%，Urel乙=078%。

根据样品测量方法得护肝片（批号：20130512）中5种成分的含量为X腺=029mg/片，X醇=056mg/片，X酯=013mg/片，X甲=014mg/片，X乙=029mg/片。则5种成分含量的相对合成不确定度分别为mg/片，Ux醇=056×086%=00048mg/片，Ux酯=013×067%=00009mg/片，Ux甲=014×074%=00010mg/片，Ux乙=029×078%=00023mg/片。

36计算扩展不确定度及测量结果取95%的置信概率，包含因子k=2，则U=2×Ux，本次实验所测量样品的含量及不确定度见表3。

4讨论

分析评估不确定度，应尽量注意产生不确定度的所有来源，因为合成不确定度的数值取决于重要的不确定度分量。从表2各标准分量的不确定度可知，本研究测定护肝片中5种成分结果的各分量不确定度均较小，测量结果的不确定度主要来源于对照品的配制和样品溶液进样重复性的不确定度。在分析了上述影响测量不确定度原因后，在以后的试验中加以注意和改进。选择精密度高的单标线移液管，尽可能减少量取的次数并尽量选用容量相对大的量具，样品测量应在基线平稳后进样，同时尽量保持标准溶液和供试品溶液测定条件相同，使测量结果更加可靠，测量结果的不确定度进一步减小。本研究所建立的方法考虑了HPLC测定过程中产生不确定度的大部分因素，为同类方法测量结果的不确定度评定提供有益的参考。

参考文献

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（收稿日期：20160323）