土家族麝针疗法对缺血性脑中风大鼠的脑保护作用机制研究

涂星　张燕　向阳　田春漫　张棋　郜红利

【摘要】目的：观察土家族麝针疗法对缺血性脑中风大鼠的脑保护作用，并初步探其作用机制。方法：以雄性SD大鼠为研究对象，随机分为假手术组、模型组、天然麝香麝针组和人工麝香麝针组。采用线栓法制备大鼠脑缺血性中风模型，按照Zea-longa5级评分法选取造模成功的大鼠，分别给予相应治疗措施。采用Garcia复合评分法评价大鼠神经功能；采用全自动血液流变学检测仪检测大鼠全血粘度、血小板最大聚集率、凝血酶时间和凝血酶原时间；采用Elisa法测定血清中细胞因子IFN-β和TNF-α的含量；SP法测定脑组织中NF-κB p65的表达情况。结果：采用线栓法建立的缺血性脑中风大鼠Garcia神经功能评分、凝血酶时间和凝血酶原时间显著下降，全血粘度、血小板最大聚集率、TNF-α的含量和NF-ΚB p65阳性细胞表达显著升高（P<005）；采用土家麝针疗法治疗后，其神经功能评分、凝血酶原时间、干扰素-β的含量显著升高，全血粘度、血小板最大聚集率、TNF-α的含量和NF-κB p65阳性细胞表达显著降低（P<005），对凝血酶时间无显著影响；天然麝香与人工麝香所制备的麝针疗法对上述指标的影响无显著差异，但前者恢复神经功能起效迅速，持续作用效果更明显。结论：线栓法所致缺血性脑中风的神经功能损伤可能与血黏度和血小板最大聚集率增加、凝血酶时间和凝血酶原时间的缩短、血清中细胞因子TNF-α含量的升高及脑组织中NF-κB p65阳性细胞表达增加有关。土家麝针疗法可显著改善缺血性脑中风的神经功能，其机理可能与改善其血液流变学特征，降低促炎因子TNF-α释放而增加神经保护因子干扰素-β的释放、降低脑组织中NF-κB p65阳性细胞表达有关。人工麝香可替代天然麝香作为麝针疗法的药物来源。

【关键词】土家麝针疗法；缺血性脑中风；血液流变学；肿瘤坏死因子-α；干扰素-β；核转录因子 P65

【中图分类号】R29【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）10-0002-06

Abstract：Objective To observe the protective effect of Tujia medicine Musk needle therapy on ischemic stroke in rats and preliminary explore the mechanism of the effect.Methods Male Sprague Dawley rats was used as the research object， and all rats were randomly divided into sham-operation group， model group， natural musk needle group and synthetic musk needle group. The ischemic stroke model was prepared by thread approach， screened the ischemic stroke rats according to Zea-longa scoring method. Rat in natural musk needle group and synthetic musk needle group were given needle therapy twice a day， 5 days for a period of treatment， for a total of 3 period of treatment； rats in sham-operation group and model group were fetched and bind fixed without needle therapy as the same time. Then Garcia scoring method was used to evaluate the neurological function； automatic hemorheology detector was used to analysis the whole blood viscosity（WBV）， platelet maximum aggregation rate（PMAR）， thrombin time（TT） and prothrombin time（PT）； enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA） method was used to detect the levels of interferon factor beta（IFN-β） and tumor necrosis factor alpha（TNF-α）； SP immunohistochemical method was used to detect the positive expression of nuclear factor-κB（NF-κB） p65 in brain tissue. Results Garcia score， PT， TT decreased significantly while WBV， PMAR， level of TNF-α and positive expression of NF-κB p65 increased significantly in ischemic stroke model rats. The Garcia score， PT， increased significantly while WBV， PMAR， level of TNF-α and positive expression of NF-κB p65 decreased significantly after treating by Tujia medicine musk needle therapy， but it had no effect on TT. There no difference of these indexes between natural musk needle group and synthetic musk needle group， but it showed that the natural musk needle worked more quickly and continued for a long time. Conclusions Theneurological deficit of ischemic stroke caused by thread approach may have something to do with the increasing of WBV and PMAR， decreasing of TT and PT， increasing level of TNF-α and positive expression of NF-κB p65. Tujia medicine musk needle therapy has a goodneuronal function restoration effect on theischemic stroke rats. The mechanism may be related to improve the blood rheology characteristic， reduce the release of pro-IFNlammatory factors like TNF-α while increase the release of the nerve protection factor like IFN-β and lower the positive expression of NF-κB p65 cells in brain. Synthetic musk could use as a alternative source of natural musk in Tujia medicine musk needle therapy.

Keywords：Tujia medicine musk needle therapy；ischemic stroke； blood rheology characteristic； TNF-α； IFN-β； NF-κB p65

麝针疗法是土家族民间流传甚久的一种常用治疗方法，对脓疱、疖肿、疔疮、关节扭伤所致肿胀瘀血疼痛、急症暴症、伤寒头痛等均有较好的疗效。麝针是用香獐子的门牙制成，抓捕时扣掉牙（长约5～8cm，呈半圆形，根部稍大，前端尖锐，齿内有骨髓填满），挑出骨髓，从根部放入麝香，然后将根部扎紧，封闭，将前端磨锐，即得[1]。田琨等[2]采用头皮麝针治疗中风病30例，发现完全恢复16例，显效10例，好转3例，总有效率为966%。

香獐子又名原麝，主要分布与人迹罕至的针阔混交林带，香獐子属于国家一级重点保护野生动物，使得土家族麝针疗法的发展受到了极大的限制。研究采用自制麝针替代传统土家族麝针，探讨土家族麝针疗法对线栓法所致脑缺血中风模型大鼠的脑保护作用及其机制，促进土家族医药的发展。

1材料与方法

11材料

111实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠70只，5～7周龄，体重（200±20）g，购于重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（渝）2012-0001。

112药品和试剂天然麝香（湖北民族学院中医药学院实验室自存，经湖北民族学院中医药学院朱敏英副教授鉴定为麝科动物雄性林麝Moschus berezovskii Flerov位于肚脐和生殖器之间的腺体中的干燥分泌物）；人工麝香（纯麝香粉，批号：20141025，安徽亳州国药中药草堂）；水合氯醛（CP，批号：150307，广州化学试剂厂）；兔抗大鼠多克隆核转录因子（NF-κB p65）（一抗测定试剂盒，批号：BA0610，武汉博士德生物试剂公司；二抗测定试剂盒，批号：501101，北京中杉金桥生物技术有限公司）；TNF-α ELISA 试剂盒（批号：E013116，美国eBioscience公司）；IFN-β（美国eBioscience公司）等。

113仪器一次性注射针头（5号，05mm外径，针头长度2cm）；全自动血液流变学检测仪（天津市冠嘉医疗设备有限公司）；BX41 数码显微镜（日本OLYMPUS公司）；DRP-9082型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；电热恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；LEICA300脱水机、LEICA RM2235切片机、LEICA EG1150石蜡包埋机（德国徕卡公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）；L420台式低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；低速高温离心机（美国Thermo Electron公司）；酶标定量测定仪（德国Thermo公司）；超纯水纯化系统（美国Millipore公司）等。

12方法

121脑缺血中风模型大鼠的制备和评价参考文献[3-4]制备尼龙线：取直径为025mm的尼龙线，剪成50mm长的小段，在线的一端用酒精灯烧成光滑的圆球，并在距球端180mm处用红色记号笔标记，备用。用前以消毒酒精擦拭。

取SD大鼠，随机分为模型组（n=60）和假手术组（n=10）。参考文献[5-6]，采用颈内动脉线栓法制备大鼠脑缺血中风模型。用10%水合氯醛030g/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈前正中纵形切口，钝性分离皮下组织和肌肉，分离出左侧总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA近心端和远心端及ICA挂上手术线备用，微动脉夹夹住ICA，然后在近心端用手术线结扎CCA、ICA。在ECA距离ICA分叉处2～3mm处用小剪刀剪开一小口，将上述尼龙线插入ECA 并进入CCA，轻扎备线，防止出血，剪断ECA，松开ICA 的动脉夹，牵引ECA，使其和ICA 约成一直线，轻轻回抽尼龙线，使其顺入ICA，继续向下推进约18 mm。松开CCA 动脉夹，扎紧备线，外留1 cm 长线头，缝合皮肤，回笼饲养。假手术组大鼠同法分离动脉后不进行线栓栓塞，缝合肌肉和皮肤。

按照Zea-Longa5级评分法[7-8]对造模大鼠进行评分：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈，成追尾状；3分，爬行时向对侧倾倒；4分，不能自然行走，意识丧失。1～4分大鼠为成功的脑缺血中风模型大鼠，选取评分为1～3分的大鼠开展后续实验。

122麝针的制备和鉴定[2，9]分别称取天然麝香和人工麝香各10g，溶于100ml 95%乙醇溶液中，待完全溶解呈淡黄棕色溶液后，将5号一次性注射针头浸泡入内1周。随机抽取3～5根针头，置于载玻片上，滴加10%水合氯醛2滴，10min后显微镜下（10×40倍）观察。

123头皮麝针的干预和治疗取Zea-Longa评分1～3分的模型大鼠，随机分为模型对照组、天然麝香麝针组和人工麝香麝针组。各组大鼠以俯卧位固定，选取其对侧头皮的运动区、感觉区和足运感区。采用自制麝针进针，针应刺在肌层，以200次/min以上的速度快速捻针，至针刺区微感发热。捻转5min后，留针5min，反复捻针留针3次后起针，每日进行2次，5天为一个疗程，每疗程间休息2天，治疗3个疗程。

124疗效评价及作用机制研究

1241神经功能评价采用Garcia 18分的复合评分法[10-11]，在治疗前、1、2、3疗程结束后的4个时间点随机选取10只大鼠进行神经功能评分测定，由两名实验人员在不知分组情况下进行评价，取平均值。

1242血液流变学指标检测分别于治疗前、1、2、3疗程结束后2h，随机抽取各组大鼠6只，颈动脉取血（取血大鼠依然存活），置于盛有肝素钠的试管中，采用全自动血液流变学检测仪按照操作规程检测其切变率为150s-1时的全血粘度（WBV）、血小板最大聚集率（PMAR）、凝血酶时间（TT）和凝血酶原时间（PT）。

1243血清细胞因子IFN-β和TNF-α的含量检测分别于治疗前和治疗3疗程结束后2h，随机抽取各组大鼠6只，颈动脉取血，置于离心管中，37℃静置待其凝固后，3000rpm离心10min，取上清液，即得血清，-80℃保存。采用ELISA法测定各组大鼠血清中IL-2和IL-4的含量。取冻存的血清，4℃下融化，待测；在标准品孔中加入不同浓度标准品50μl，待测样品孔加入血清样本50μl，再分别加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体100μl，封板膜封住反应孔，37℃恒温孵育1h，弃去液体，吸水自拍干后加入洗液静置1min，甩去水液，吸水纸上拍干，重复洗板5次；另设空白孔不予处理作为对照。所有孔加入底物A、B各50μl，37℃恒温避光孵育15min。所有孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

1244NF-κB p65的表达情况取颈动脉取血的大鼠，10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，迅速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，向左心室注射冷09%生理盐水，观察到大鼠眼球和肺逐渐变白，且右心耳流出无色液体时，改为灌注pH74的4%多聚甲醛缓冲液，固定，立即断头取脑。将大鼠脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡切片，HE染色，采用SP法按照试剂盒说明书进行免疫组化染色。在40倍显微镜下，每张切片随机选取6个视野，精确计数单位面积（1个40倍视野）内的阳性细胞数量。NF-κB p65的阳性表达细胞存在于细胞核或胞浆中，呈棕黄色。另取健康无任何操作大鼠作为空白对照。

125统计学方法采用SPSS 170软件进行数据统计分析，计量资料结果采用（x±s）表示。若数据符合正态分布，则采用单因素方差分析（ONE-Way-ANOVAL），两两比较采用LSD法；若数据不符合正态分布，则采用秩序和检验。P<005表示差异有统计学意义。

2结果

21土家族麝针的制备和评价在400倍显微镜下可见，本实验所制备的天然麝香麝针的针头表面附着有棕黄色长方形或方形结晶和油滴，人工麝香麝针的针头表面无明显的结晶。该结果与文献报道[9]一致。

22脑缺血中风大鼠模型的建立和评价结果造模时左侧总动脉、颈外动脉和颈内动脉的分离方法见图1-A。造模结束后，Zea longa评分1～3分的模型大鼠共计有48只，随机分为模型对照组、天然麝香麝针组和人工麝香麝针组各16只。大多数大鼠出现向外侧转圈，成追尾状或爬行时向对侧倾倒的现象（图1-B），提尾悬空时出现右侧上肢的屈曲（图1-C）。

23神经功能评价由表2可见，脑缺血中风模型大鼠Garcia神经功能评分显著降低，表明其神经功能受损，且随着时间的延长评分逐渐降低（P<005）；采取土家麝针疗法2～3个疗程后，其神经功能评分显著升高（P<005），且天然麝香与人工麝香所制备的麝针疗法差异无统计学意义（P>005）。

从疗程看，土家麝针疗法起效时间在接受治疗2个疗程后（P<005），人工麝香麝针组治疗2个疗程和3个疗程对神经功能的影响无统计学差异（P>005），而天然麝香麝针组治疗3个疗程后其神经功能的改善效果较2个疗程更为显著。

24血液流变学检测结果由表3、表4可见，治疗前各治疗组大鼠的血液流变学指标与模型对照组差异无统计学意义（P>005），表明结果有可比性；颈内动脉线栓法所致脑缺血中风模型大鼠的全血粘度和血小板最大聚集率显著升高（P<005），而凝血酶时间和凝血酶原时间显著下降（P<005），提示脑缺血中风的发生机制可能与血液流变学密切相关；给予土家族麝针疗法治疗后，两组大鼠的全血粘度和血小板最大聚集率显著降低（P<005），而凝血酶原时间显著升高（P<005），且显著高于正常水平（P<005），对凝血酶时间无显著影响（P>005）；天然麝香麝针组和人工麝香麝针组在对全血粘度、血小板最大聚集率和凝血酶原时间差异无统计学意义（P>005）。

25血清细胞因子IFN-β和TNF-α的含量检测结果由表5可见，模型对照组与假手术组干扰素-β的含量差异无统计学意义（P>005），天然麝香麝针组和人工麝香麝针组干扰素-β的含量均显著升高（P<005），且两组差异无统计学意义（P>005）；而模型对照组TNF-α的含量显著升高（P>005），给予天然麝香麝针和人工麝香麝针治疗后，其含量显著降低（P<005），且两者差异无统计学意义（P>005）。

26NF-κB p65的表达结果由表6、图3可见，各组均可见NF-κB p65阳性细胞，假手术组较空白组明显增多（P<005），3疗程后其表达显著降低（P<005），与空白组无统计学差异（P>005），提示单纯的分离颈动脉和缝合操作也能导致脑组织中NF-κB p65阳性细胞表达增加，但随着伤口愈合而恢复正常；与空白对照组比较，造模后NF-κB p65阳性细胞表达显著增高（P<005），提示脑组织中NF-κB p65阳性细胞表达增加可能是脑缺血中风的重要发病机制之一；经给予土家族麝针疗法后，天然麝香麝针组和人工麝香麝针组NF-κB p65阳性细胞表达数均显著下降（P<005），且两者之间差异无统计学意义（P>005），提示土家麝针疗法能下调脑缺血中风所致脑组织中NF-κB p65阳性细胞表达，且天然麝香和人工麝香的疗效差异无统计学意义。

3讨论

脑缺血性中风是由于某脑动脉供血区的血流因栓塞或血栓而暂时或永久地减少所致，其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应，属于中医“中风”、“卒中”、“偏枯”范畴，占中风患者的80%，具有高发病率、高死亡率和高致残率等危害，是中老年人的常见病、多发病之一[12]。其病机特点为本虚标实，气血阴阳虚衰，在风、火、痰、瘀的影响下而发病，其病变的主要原因是气虚血瘀，临床研究发现中风患者的血液多处于粘、浓、凝、聚的病理状态，全血粘度、红细胞压积、血小板最大聚集率显著增加而凝血酶时间和凝血酶原时间显著下降[13-14]。实验结果表明，土家族麝针疗法可以显著改善脑缺血性中风大鼠的全血粘度，抑制血小板最大聚集率，增加凝血酶原时间，有效防止缺血脑组织的进一步损害，且采用天然麝香或者人工麝香制作的土家族麝针在疗效上无显著差异。

国际脑卒中治疗临床前研究指南（STAIR）指出，在脑缺血药物研究中，多重指标综合评价很重要，组织学和行为学的结果都应评价。国内主要采用Zea-Longa评分标准，一定程度上反映了神经功能的损伤，但该种方法只关注了运动功能和所造模型损伤症状，不能全面、细致的反应脑缺血性中风的神经功能损伤[15]。Garcia JH评分详细评价了脑缺血性中风动物的运动功能和感觉功能的损伤，建立了较为完整的评分方法[16，10]。研究中采用Zea-Longa评分作为神经功能损伤的判断标准，采用Garcia评分作为神经功能损伤程度的判断标准。结果发现，采用线栓法制备的脑缺血性中风模型大鼠不同程度的存在神经功能缺损，土家族麝针疗法治疗能显著改善其病理状态，且天然麝香麝针组的长期疗效更佳。

脑缺血后炎性介质大量表达是缺血中心区和周围区神经元损伤的重要因素之一。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的过度表达可加重神经功能损伤，扩大脑梗死范围，导致缺血脑组织血流量减少，从而加重血脑屏障的损害，促进脑缺血和水肿的发生发展，最终导致细胞坏死或凋亡；干扰素-β（IFN-β）具有较好的免疫调节作用，能保护正常细胞免受NK细胞的杀伤，在短暂缺血性中风后具有神经保护功能[17-19]。研究发现，线栓法所致脑缺血性中风模型大鼠的脑组织中TNF-α的含量显著增加，而IFN-β的含量无明显变化；采用土家麝针疗法进行干预治疗后，IFN-β的含量显著增加，而TNF-α的含量显著降低，且天然麝香麝针组和人工麝香麝针组的治疗效果无显著差异，表明土家麝针疗法治疗脑缺血中风的作用机制可能是通过上调IFN-β的表达、下调TNF-α的表达，减少神经功能的损伤，增强机体的免疫调节能力，改善脑区血流量。

核转录因子（NF-κB）是细胞内最重要的核转录因子，广泛存在于多种细胞中，能与多种基因启动子或增强子上的κB位点发生特异性结合并促使基因转录的蛋白质，其中p65（RelA）是NF-κB 家族中的一个重要亚基。在脑缺血损伤时，NF-κB可被细胞因子（TNF-α、IL-1β等）、氧自由基、钙超载等因素刺激而活化，活化的NF-κB又可诱导细胞因子、粘附因子、免疫受体、炎性酶类的表达及氧自由基形成等，从而加剧脑缺血后继发炎性脑损伤[20-22]。研究发现，线栓法所致脑缺血中风模型大鼠脑组织中NF-κB p65的阳性表达显著增加，经土家族麝针疗法干预和治疗后，其阳性表达量显著降低，且天然麝香麝针组和人工麝香麝针组之间无显著差异。

总之，土家族麝针疗法对脑缺血性中风具有较好的脑保护作用，尤其对其所致的脑神经功能损伤具有较好的保护和恢复作用，其作用机理可能与降低全血粘度、抑制血小板最大聚集率、增加凝血酶原时间、上调IFN-β的表达、下调TNF-α的表达、抑制NF-κB p65细胞阳性表达等有关。天然麝香制备的麝针虽然在改善凝血酶时间和凝血酶原时间上具有一定的优势，但其他指标均无显著差异，提示可采用人工麝香作为替代品，达到临床效果相同而减小治疗成本的目的。但土家麝针疗法治疗脑缺血中风发挥作用的是针灸还是麝香中的主要成分尚不清楚，有待进一步研究。

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（收稿日期：20160226）