双波长HPLC法同时测定玄麦甘桔颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

舒柯

【摘要】目的：建立以双波长HPLC法同时测定玄麦甘桔颗粒中哈巴苷、哈巴俄苷含量的方法。方法：色谱柱Dikmaonsil C18（250mm×46mm，5μm）；以乙腈（A）-01%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0～18min，5%A；18～25min，5%～29%A；25～55min，29%A；55～56min，90%A；56～60min，5%A；检测波长为210nm（哈巴苷）和 278 nm（哈巴俄苷），体积流速1ml/min；柱温：30℃。结果：哈巴苷、哈巴俄苷的进样量线性范围分别为003931μg～04914μg、0005835μg～004862μg，回归方程分别为Y=20511X+10747，r=09997、Y=12246X+0596，r=09997；二者的平均加样回收率分别为960%、1022%，RSD分别为13%、12%（n=6）。结论：所建立的双波长法能方便、快速地对中药中多种成分同时测定，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】玄麦甘桔颗粒；哈巴苷；哈巴俄苷；双波长高效液相色谱法；含量测定；质量控制

【中图分类号】R2860【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）10-0031-03

Abstract：Objective To establish a method for Simultaneous Determination of the content of harpagide and harpagoside in Xuanmai Ganjie grains. Method The analysis was carried on a column of C18（Dikmaonsil C18，250mm×46mm，5μm）at 30℃；acetonitrile（A）-01%Phosphoric Acid（B） by gradient elution （0～18min，5%A；18～25min，5%～29%A；25～55min，29%A；55～56min，90%A；56～60min，5%A） as mobile phase；the flow rate was 10ml/min；The detection wavelength was set at 210 nm for harpagide，and at 278 nm for harpagoside . Results The linear ranges of harpagide and harpagoside were 003931μg～04914μg（r=09997）、0005835μg～004862μg（r=09997），the regression equation as Y=20511X+10747， r=09997、Y=12246X+0596，r=09997. Average recoveries of them were 960%，1022%，RSD were 13%，12%，respectively（n=6）.Concluslon Dual wavelength HPLC method can be used for simultaneous determination of ingredients of traditional Chinese medicine，and can satisfy the requirements of quality control.

Keywords：Xuanmai Ganjie grains； harpagide； harpagoside； Dual-wavelength HPLC； Content determination； Quality control

玄麦甘桔颗粒由玄参、麦冬、甘草、桔梗四味药材组成，具有清热滋阴，祛痰利咽的功效，用于阴虚火旺，虚火上浮，口鼻干燥，咽喉肿痛。现行质量标准中除TLC鉴别外，只有甘草中甘草酸和玄参中哈巴俄苷的含量测定项目，对于中药制剂的质量控制尚不全面。方中玄参具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效，玄参中主要的活性化学成分为环烯醚萜类和苯丙苷素类，其中哈巴苷和哈巴俄苷为主要的环烯醚萜苷类成分，且采用双波长HPLC同时测定玄麦甘桔颗中哈巴苷、哈巴俄苷的含量的方法未见报道。研究根据相近产品检测方法的文献报道[1-2]，采用双波长高效液相色谱同时检测哈巴苷和哈巴俄苷的含量，可更有效的控制产品质量。

1仪器与材料

11仪器Ultimate 3000高效液相色谱仪（DAD检测器）；METTLER TOLEDO AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500DA型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）。

12材料哈巴苷（批号：111729-201204）、哈巴俄苷（批号：111730-201106）对照品由中国药品生物制品检定院提供。玄麦甘桔颗粒（批号：ZCA1413，云南白药股份有限公司）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

21 色谱条件色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以01%磷酸为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm、278nm；柱温：30℃；流速：10ml/min，进样量：20μl。

22对照品溶液的制备取哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加30%甲醇制成每1ml含哈巴苷25μg、哈巴俄苷20μg的混合溶液，即得。

23供试品溶液的制备取装量差异下的本品，混匀，取适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率35kHz）30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

24线性关系考察精密吸取哈巴苷对照品溶液（19656μg/ml）2、4、7、10、25μl，吸取哈巴俄苷对照品溶液（1945μg/ml）3、5、10、20、25 μl，依次注入液相色谱仪测定峰面积。计算回归方程：哈巴苷对照品Y=20511X+10747，r=09997；哈巴俄苷对照品Y=12246X+0596，r=09997，表明哈巴苷、哈巴俄苷分别在3931～4914ng、5835～4862ng范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

25精密度试验取“22”项下的哈巴苷、哈巴俄苷对照品溶液，在“21”项的色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，计算哈巴苷、哈巴俄苷的RSD分别为18%、03%。

26重复性试验取同一批样品，按“23”项下方法制备6份供试品溶液，在“21”项下进行峰面积测定，得到哈巴苷、哈巴俄苷的RSD均为12%，结果表明该方法重复性良好。

27稳定性试验取同一样品，按“23”项下方法制备1份供试品溶液，溶液分别放置2、4、8、12、18h后各进样20μl，测定哈巴苷、哈巴俄苷的峰面积，其RSD分别为18%、10%。

28加样回收率试验取已测定含量的玄麦甘桔颗粒1g，精密称定，置于三角烧瓶中，精密加入哈巴苷、哈巴俄苷对照品混合溶液（7416ng/ml、05580ng/ml）25ml，按“23”项下方法制备供试品溶液，计算回收率，结果哈巴苷平均回收率为960%，RSD为13%；哈巴俄苷平均回收率为1022%，RSD为12%。结果见表1。

29样品含量测定分别取玄麦甘桔颗粒样品6份，按“23”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标法计算样品中哈巴苷和哈巴俄苷的含量。结果哈巴苷、哈巴俄苷的含量分别为01256mg/g、00472mg/g。对照品、供试品色谱见图1。

3讨论

在供试品溶液制备中，分别对超声提取和回流提取进行了比较，结果显示回流提取和超声提取没有显著性差异，故选用超声提取。对超声提取时间15～60min进行了比较，结果显示提取30min后，样品中哈巴苷、哈巴俄苷基本提取完全，故采用超声提取30min。流动相选择上曾选用不同比例的乙腈-甲酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液为流动相，但基线不稳定，哈巴苷、哈巴俄苷与相邻色谱峰不能完全分离且峰形不对称。参照中国药典[3]及文献[4]的方法，采用乙腈-01%磷酸溶液梯度洗脱，方得满意结果。

试验中，将哈巴苷、哈巴俄苷对照品混合溶液，在DAD进行全波长紫外扫描。结果，哈巴苷在210nm处，哈巴俄苷在278nm处吸收值最大，并在此处无干扰，故选择双波长，在210nm测定哈巴苷，在278nm测定哈巴俄苷。

中药复方制剂成分复杂，有效成分往往难以明确，其质量控制是一项系统复杂的工程。提高中药质量控制的水平，增加质量标准对于保证产品的质量，保证制剂的稳定性、安全性和有效性，有着重要意义。控制中药复方制剂最有效的手段是采用多种成分同时进行定量测定。玄麦甘桔颗粒相关的研究文献多限于选择单独测定哈巴苷或者哈巴俄苷含量，本研究采用的双波长高效液相色谱法，同时测定玄麦甘桔颗粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，该方法灵敏度、精密度均能达到检测要求，进一步为企业提供了质量控制，同时作为一种质控手段从操作简便性上具有一定的意义。

参考文献

[1] 李振东，徐位良，罗娇艳. HPLC法测定玄麦甘桔颗粒中哈巴俄苷与肉桂酸含量[J]. 广东药学院学报，2008，24（2）：130-132.

[2] 蒋华科，陈纯，符孝军.高效液相色谱法测定玄麦甘桔颗粒中甘草酸的含量[J].中南药学，2012，10（2）：103-105.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：102.

[4] 杨辉.双波长UPLC法同时测定艾滋病口腔含簌液中梓醇、哈巴苷和哈巴俄苷的含量[J].天中国药房，2015，26（24）：3414-3415.

（收稿日期：20160324）