超高效液相色谱法快速测定纺织品中5种异噻唑啉酮类抗菌剂

谢堂堂　王成云　林君峰　沈雅蕾　李燕华　褚乃清

(深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心，深圳 518067))

仪器应用

超高效液相色谱法快速测定纺织品中5种异噻唑啉酮类抗菌剂

谢堂堂王成云林君峰沈雅蕾李燕华褚乃清

(深圳出入境检验检疫局工业品检测技术中心，深圳 518067))

摘要：建立了高效液相色谱分析方法，对纺织品中5种异噻唑啉酮类抗菌剂含量进行了同时测定。样品经甲醇超声萃取，提取液经浓缩定容后，直接进行高效液相色谱法测定，外标法定量。该方法的检出限为0.25～1.00mg/kg，加标平均回收率为88.82～ 97.92%，实验室内精密度(RSD)为0.62～1.96%，实验室间精密度(RSD)为1.09～ 2.31%。采用该方法对市售纺织品中异噻唑啉酮类抗菌剂含量进行测定，结果在6个样品中检出了不同含量的2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮(OI)。

关键词：超高效液相色谱法纺织品异噻唑啉酮抗菌剂

1引言

异噻唑啉酮类抗菌剂是一类新型广谱高效杀菌剂，广泛应用于纺织品、造纸、皮革、涂料、化妆品、玩具等领域[1-12]，目前大量使用的品种有2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)、1,2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)、2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮(OI)、4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮(DCOI)等。鉴于其应用广泛，人们对其毒性进行了大量研究后发现[13-16]，MI、CMI和BIT具有接触致敏性，能引发接触性皮炎。欧盟国家部分企业要求进入欧盟市场的纺织品中OI含量不得高于10mg/kg，EN 71-9-2005规定MI、CMI、BIT的限量分别为10、10、5mg/kg，且MI、CMI总量不得超过15mg/kg，欧盟生物杀灭产品法规EU No.528/2012将DCOI列入管制范围。异噻唑啉酮类抗菌剂可采用紫外-可见分光光度法[17，18]、高效液相色谱法[19-27]、气相色谱法[28]、气质联用法[23, 29-32]、液相色谱-串联质谱法[33-36]等方法测定，但文献报道的测定对象均未涵盖上述全部5种异噻唑啉酮类抗菌剂。尽快建立同时检测纺织品中上述5种异噻唑啉酮类抗菌剂的方法，具有十分重要的意义。本实验选取真丝、亚麻、棉等纺织品进行研究，以甲醇为溶剂进行超声萃取，萃取液浓缩定容后进行UPLC分析，建立了同时测定纺织品中5种异噻唑啉酮类抗菌剂含量的高效液相色谱方法。

2试验部分

2.1仪器与试剂

标准品MI(纯度100.0%，美国Sigma- Aldrich公司)；CMI(纯度99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer公司)；BIT(纯度99.2%，美国Sigma-Aldrich公司)；OI(纯度99.9%，美国Sigma-Aldrich公司)；DCOI(纯度99.8%，日本东京化成株式会社)；色谱纯甲醇(美国Tedia公司)；分析纯甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、四氢呋喃、石油醚、二氯甲烷(广州化学试剂厂)；水(二级水)。

Shimadzu LC- 20AD XR高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；Heidolph 4003旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；0.22μm滤膜(德国Membrane公司)；SB 25-12DTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2.2标准溶液的配制

分别称取适量的标准品，用甲醇配成质量浓度约为2000μg/mL的标准溶液储备液。分别移取适量体积的各标准溶液储备液，用甲醇配成混标储备液。混标储备液中各组分的质量浓度分别为242.2(MI)、242.7(CMI)、240.7(BIT)、242.9(OI)、244.8μg/mL(DCOI)。测定时用甲醇逐级稀释，配成混标工作液。

2.3样品处理

将样品剪碎成小于5mm×5mm的小块，混匀。称取1.0g样品，置于磨口锥形瓶中，加入20mL甲醇，在45℃超声萃取20min，过滤，残渣再次用20mL甲醇超声萃取，合并萃取液，真空旋转蒸发浓缩至近干，用甲醇定容至5mL，经0.22μm滤膜过滤后进行UPLC分析。必要时，先进行稀释或浓缩。

2.4分析条件

Shim-pack XR-ODS色谱柱(100mm×3.0mm×2.2μm)，柱温40℃，流速0.4mL/min，进样量1.0μL，洗脱梯度见表1，检测波长分别为275(MI)、277(CMI)、319(BIT)、279(OI)、283nm(DCOI)。

表1　洗脱梯度

3结果与讨论

3.1萃取条件优化

以甲醇为萃取溶剂，分别在30、35、40、45、50、55、60℃下对3个阳性样品(材质分别为真丝、亚麻布、棉布，均含有OI)超声萃取20min，观察OI萃取量随萃取温度的变化，结果发现，对于3个阳性样品，超声萃取温度对萃取量影响不大。考虑到实验室通常的温度和控制温度的便利，超声萃取温度选定为40℃。

以甲醇为萃取溶剂，40℃下对3个阳性样品分别超声萃取5、10、15、20、25、30、35、40min，观察OI萃取量随超声时间的变化，结果发现，对于3个阳性样品，萃取量均随萃取时间的增加而增加，并在20min时达到最大值，萃取时间继续增加时，萃取量均反而缓慢下降。因此，超声萃取时间确定为20min。

以甲醇为萃取溶剂，40℃下对3个阳性样品超声萃取20min，甲醇体积分别为10、15、20、25、30mL，观察OI萃取量随萃取溶剂体积的变化，结果发现，对于3个阳性样品，萃取量均在溶剂体积为20mL时达到最大值。因此，超声萃取溶剂体积确定为20mL。

为综合考虑萃取时间、萃取温度和萃取溶剂体积对萃取量的影响，按表2的条件进行了正交实验，并给出了各条件下3个阳性样品的萃取量。正交实验结果表明，条件5#下3个阳性样品的萃取量均最大。因此，超声萃取条件最终优化如下：以20mL甲醇为萃取溶剂，45℃下超声萃取20min。

表2　超声萃取条件正交实验　 mg/kg

以20mL甲醇为萃取溶剂，45℃下对3个阳性样品超声萃取20min，连续萃取3次，测定每次的萃取量，以连续3次萃取量为参照，计算每次萃取量占总萃取量的比例，结果发现，棉布第1次萃取量占总萃取量的94.58%，第2次萃取量占总萃取量的5.42%；亚麻布第1次萃取量占总萃取量的93.28%，第2次萃取量占总萃取量的6.72%，真丝第1次萃取量占总萃取量的93.78%，第2次萃取量占总萃取量的6.22%。对于3个阳性样品，第3次萃取量均未检出OI，可见，经2次连续萃取，样品中的OI均已被萃取完全。因此，确定采用2次连续萃取方式。

据文献报道，通常可采用甲醇、水、乙腈、四氢呋喃等溶剂来提取异噻唑啉酮等抗菌剂，为了确定合适的萃取溶剂，分别以水、甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、四氢呋喃、石油醚和二氯甲烷等10种常见溶剂作为萃取溶剂，对3个阳性样品(材质分别为真丝、亚麻和棉)进行2次连续超声萃取，观察不同溶剂时萃取量的变化，结果见表3。从表3可知，对于3个阳性样品，甲醇的萃取效果均最好，特别是真丝样品，甲醇的萃取效果远高于其他溶剂。因此，萃取溶剂最终确定为甲醇。

表3　不同溶剂的超声萃取效果　mg/kg

3.2分析条件的优化

在210～350nm范围测定各标准品溶液的紫外-可见吸收光谱，发现各组分在此范围内各有一个强吸收峰，其波长分别为275(MI)、277(CMI)、319(BIT)、279(OI)、283nm(DCOI)，如图1所示。选择最大吸收波长作为检测波长时，相应的吸光度最大，有利于提高各组分的检测灵敏度。因此选择各组分的最大吸收波长作为检测波长。

图1　标准溶液的紫外-可见吸收光谱1.MI; 2.CMI; 3.OI; 4.DCOI; 5.BIT

在反相液相色谱中，流动相通常使用水/甲醇、水/乙腈等强极性流动相，分别考察了水/乙腈、水/甲醇2种流动相，结果发现，使用水/甲醇流动相时基线平稳，色谱峰峰形尖锐，对称性好，保留时间和峰面积的精密度和重现性较好；使用水/乙腈流动相时，基线漂移比较严重，色谱峰峰形较差，且乙腈毒性大于甲醇，因此选择水/甲醇作为流动相。

色谱柱的柱压随流动相的组成、流速和色谱柱温度的改变而变化，流动相中水的比例越高、柱温越低、流速越大时，柱压越高。色谱柱通常有一定的柱压承受范围，在选择色谱分析参数时，最大柱压应在可承受柱压范围内。流动相的组成、流速、色谱柱温度均直接影响分离效果和方法灵敏度，流速较小时，柱压较小，各组分的保留时间和峰面积均较大，但峰形展宽，分离度下降；柱温升高时，峰面积变化不明显，但柱压明显降低，各组分的保留时间变小，峰形变窄，但各色谱柱均有一定的使用温度范围，过高的柱温会损伤色谱柱。改变流速、洗脱梯度和柱温，观察各组分的分离效果及峰面积的变化，结果发现，采用2.4节中的色谱分析条件时，各组分之间分离完全，各色谱峰峰形尖锐，对称性好。图2是该条件下5种异噻唑啉酮类抗菌剂的UPLC图。

图2　5种混标的UPLC图1.MI; 2.CMI; 3.BIT; 4.OI; 5.DCOI

3.3方法的线性关系和检出限

用甲醇逐级稀释混标储备液，配制一系列的混标工作液，按上述条件进行测试，计算各组分的色谱峰面积，用色谱峰面积(A)对质量浓度(ρ)进行回归，结果发现，对于每个组分，其色谱峰面积(A)在一定质量浓度(ρ绷)范围内均与质量浓度(ρ)之间存在良好的线性关系，表4给出了各组分的线性关系。按公式LODi=3Sb/b计算仪器的检出限(LODi)，式中Sb为测试方法的空白标准偏差，该参数通过20次平行测试得到，b为校准曲线的斜率。方法检出限(LODm) =V×LODi，式中V为最终定容体积。计算结果见表4。

表4　线性关系和检出限

3.4方法的回收率和精密度

以不含目标化合物的棉、亚麻、真丝、涤纶作为空白基质，分别添加高(10倍LOD)、中(2倍LOD)、低(1倍LOD)3个浓度水平的混标，每个浓度水平制备9个平行样，按上述方法进行测定，计算方法的加标回收率和平均加标回收率。结果表明，5种异噻唑啉酮类抗菌剂的平均加标回收率为88.82～97.92%。

对3个阳性样品(材质分别为棉、亚麻、真丝)中的抗菌剂OI的含量进行9次平行样测试，计算方法的精密度(RSD)，测试结果见表5，实验室内精密度(RSD)为0.62～ 1.96%。由国内9家实验室对这3个阳性样品中抗菌剂OI含量进行测定，测试结果也列于表5中，经计算，实验室间精密度(RSD)为1.09～2.31%。

表5　方法精密度实验 　mg/kg

3.5实际样品测试

采用本实验建立的方法对256个市售纺织品进行测定，结果在6个样品中检出了不同含量的OI，这6个纺织品分别为平纹机织染色女式棉上衣、纯棉女式短袖衬衫、针织真丝女式长袖套头衫、梭织真丝连衣裙、梳织亚麻男式衬衫、梳织亚麻女式长袖衬衫，其含分别为9941.7、800.3、734.3、6527.1、8828.4、328.3mg/kg。图3是纯棉女式短袖衬衫的UPLC图，该样品中检出OI，其含量为800.3mg/kg。

图3　实际样品的UPLC图1.OI

4结论

建立了超高效液相色谱方法，可同时测定纺织品中5种异噻唑啉酮类抗菌剂的含量。方法简便快捷，分析过程耗时少，灵敏度高，检测通量大，可满足纺织品中异噻唑啉酮类抗菌剂含量检测工作的需要。

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Rapid determination of five kinds of isothiazolinones antibacterial agents in textiles by UPLC.

Xie Tangtang,Wang Chengyun, Lin Junfeng, Shen Yalei, Li Yanhua, Zhu Naiqing

(TheTestingandTechnologyCenterforIndustrialProducts,ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen518067,China)

Abstract:Isothiazolinones in textiles were extracted using methanol as the extraction solvent. Then the extract was concentrated and detected by UPLC, the external standard method was used for quantification. The limits of detection (LODs) varied from 0.25mg/kg to 1.00mg/kg. The spiked average recoveries changed from 88.82% to 97.92%. The relative standard deviation of intra-laboratory changed from 0.62% to 1.96% while the relative standard deviation of inter-laboratory changed from 1.09% to 2.31%. The proposed method was used for the determination of isothiazolinones antibacterial agents in textiles on sale, different content of 2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one were detected in six samples.

Key words:UPLC; textile; isothiazolinone; antibacterial agent

基金项目：国家认监委科研制标项目(2013B048)。

作者简介：谢堂堂，男，1982年出生，博士，高级工程师，研究方向为轻纺产品中有毒有害物质的仪器分析， tangtangxie@139.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.03.007