丹皮酚泡囊乳膏的制备及其体外透皮吸收考察

黄天擎，何瑞曦，陈贺骏涛，聂湘江，陈卫东,2,3,4，彭代银,2,3，吴德玲,2,3，戴　敏,2,3,4

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012；2.安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥　230012；3.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥　230012；4.现代中药质量控制研究安徽高校科研平台创新团队，安徽 合肥　230012)

丹皮酚泡囊乳膏的制备及其体外透皮吸收考察

黄天擎1，何瑞曦1，陈贺骏涛1，聂湘江1，陈卫东1,2,3,4，彭代银1,2,3，吴德玲1,2,3，戴敏1,2,3,4

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；2.安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥230012；3.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥230012；4.现代中药质量控制研究安徽高校科研平台创新团队，安徽 合肥230012)

[摘要]目的以泡囊为载体制备丹皮酚乳膏，优化丹皮酚乳膏的制备工艺及制备处方，并考察体外透皮吸收情况。方法用乙醇注入法制备丹皮酚泡囊；用乳化法制备丹皮酚乳膏；应用控制变量法优化制备工艺；采用正交设计优化制备处方；并采用TP-6型透皮扩散实验仪，以大鼠腹部离体皮肤作为渗透屏障，通过高效液相色谱法测定药物的累计渗透量来考察丹皮酚乳膏体外透皮吸收情况。结果基于丹皮酚泡囊制得的乳膏在12 h和24 h的累积渗透量分别是丹皮酚原料药的1.1倍和1.2倍，在24 h时皮内药物滞留量是丹皮酚原料药乳膏的1.26倍。结论基于丹皮酚泡囊制得的乳膏在有效期内各时间段的体外透皮吸收高于原料药乳膏，且丹皮酚泡囊乳膏的皮内滞留量明显高于丹皮酚原料药乳膏。

[关键词]丹皮酚；泡囊；乳膏；透皮吸收

丹皮酚是小分子酚类化合物，呈白色针状结晶，化学名称为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，提取自毛茛科植物牡丹的干燥根皮，为牡丹的根皮及中药徐长卿中主要活性成分。丹皮酚具有镇静、催眠、抗感染、抗炎、抗氧化、解热、降血压和抑制变态反应的作用[1-4]；在日用化学方面，丹皮酚能抑制细胞内氧自由基产生，将皮肤中沉积色素还原褪色，从而使皮肤增白。但由于其水溶性较差且易挥发[5]，影响其多种制剂的稳定性。采用非离子表面活性剂泡囊为载体材料，利用其独特的结构形式包裹丹皮酚，解决了丹皮酚不稳定的问题，可为丹皮酚非离子表面活性剂泡囊的临床应用提供理论基础[6]。而乳膏是一种或几种液体在乳化作用下，以液珠形式均匀分散在另一不相混溶的液体中而形成的一种稳定的多相分散体系，该体系中药物释放穿透性较好，相比较于油脂性基质更易涂布、清洗，且对皮肤有保护作用。本课题组将丹皮酚泡囊配制成有美白作用的乳膏，为了充分发挥丹皮酚的效能，其外用制剂的研制及其经皮渗透动力学的研究至关重要。因此，本课题组利用控制变量法研究了乳化时间、乳化温度、搅拌速度对丹皮酚乳膏的稳定作用，通过离心实验确定了最优制备工艺；利用正交设计方法研究了单硬脂酸甘油酯、吐温-80、1，2-丙二醇对丹皮酚乳膏的稳定作用，通过离心实验和稠度检测实验确定了最优制备处方；并采用TP-6型透皮扩散实验仪，以体外大鼠皮肤作为渗透屏障，通过高效液相色谱法检测接受液中和皮肤组织中丹皮酚的含量。

1材料

1.1仪器LC-15C高效液相色谱仪：日本岛津；AB135-S型十万分之一天平：德国梅德乐公司；85-2恒温磁力搅拌器：江苏金坛市环宇科学仪器厂；LC-4016型低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；TP-6型透皮扩散实验仪:天津市精拓仪器科技有限公司；XW-80A微型涡旋混合仪：上海泸西分析仪器厂有限公司；超滤离心管：美国Milipore；T-18-BS-25组织匀浆机： 德国IKA ；PALL超纯水仪：CascadaTMIII I。

1.2试剂丹皮酚原料药：西安瑞林生物科技有限公司，批号 110802；丹皮酚标准品：中国药品生物制品检定所，批号 110708-200506；甲醇：上海信可有限公司；无水乙醇：上海苏懿化学试剂有限公司；Spans-60：天津市福成化学试剂公司；磷酸盐缓冲溶液：北京中山金桥生物技术有限公司；胆固醇：国药集团化学试剂有限公司；聚乙二醇硬脂酸：江苏海安石化；超纯水：实验室自制；柠檬酸：上海润捷化学试剂有限公司；磷酸氢二钠：江苏强盛化工有限公司；吐温-80：天津市光复精细化工研究所；1，2-丙二醇：上海苏懿化学试剂有限公司；尼泊金乙酯：浙江圣效化学品有限公司；单硬脂酸甘油酯：张家港市中鼎添加剂有限公司；白凡士林：天津鼎盛鑫化工有限公司；十八醇：天津鼎盛鑫化工有限公司；乙腈：德国默克；水合氯醛：天津市申泰化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3动物SD大鼠，雄性，体质量(200±20)g，由江苏南京青龙山动物繁殖场提供，生产许可证号为SCXK(苏)2009-0001。

2方法与结果

2.1丹皮酚泡囊的制备通过预实验，结合丹皮酚自身物理化学性质，以包封率、载药量、平均粒径、Zeta电位等为考察指标，最终选用乙醇注入法[7-9]，即处方量的Spans-60、胆固醇、聚乙二醇琥珀酸脂与丹皮酚溶于无水乙醇中，将上述溶液以0.5 mL/min注入60 mL 55 ℃的磷酸盐缓冲溶液中并不停搅拌，直至乙醇挥发完全。结果表明，在挥发过程中无较大颗粒生成，得一呈淡蓝色乳光的液体，将所得混悬液以3 000 r/min离心，依次过0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得丹皮酚泡囊。

结果表明，本实验所制备的泡囊包封率为61.8%，载药量高达9.9%，高于正交设计中各处方的包封率；平均粒径为166 nm，Zeta电位为-17 mV。取所制得的丹皮酚泡囊涂于铜片表面，自然干燥后，置于扫描电镜下观察其显微形态，所制得泡囊成大小均一的圆球形。体外释放行为表明，表面活性剂泡囊具有明显的缓释作用[10]。

2.2丹皮酚乳膏的制备及制备工艺、处方的筛选

2.2.1丹皮酚乳膏的制备采用乳化法[11]制备乳膏，具体步骤如下：称取处方量单硬脂酸甘油酯、十八醇、白凡士林混合加热至75 ℃熔化为油相；另称取处方量吐温-80、磷酸氢二钠、柠檬酸、丙二醇、尼泊金乙酯、丹皮酚泡囊，混合、溶解，加热至75 ℃作为水相，待油相、水相溶解完全后，将水相缓缓加入油相中，搅拌转速为600 r/min，乳化温度为75 ℃，乳化20 min，取出，继续搅拌，至温度降至25 ℃，即得乳膏。

2.2.2制备工艺的筛选采用控制变量法[12-14]，以外观性状、离心稳定性(3 000 r/min离心15 min)为评判指标，在60～90 ℃的温度范围内考察制备乳膏时水相、油相的最适温度；在15～25 min的时间范围内考察水相、油相混合后的最适乳化时间；在不同搅拌速度中考察最适搅拌速度。考察结果见表1。

①当乳化时间较短时，由于乳化不完全，考察时出现稍有分层；当乳化时间过长时，考察虽未分层，但由于乳化过度，从而导致膏体较稀。根据实验结果，本乳膏的乳化时间确定为20 min。②在乳化温度低至60 ℃时，由于基质熔融不充分造成乳化不完全，从而导致制备的乳膏膏体发粗、外观无光泽且不易涂抹；当乳化温度高达90 ℃时，考察虽未分层且膏体适中，但容易降低乳化剂的稳定性，从而破坏丹皮酚泡囊；而温度控制在75 ℃左右时，制备的乳膏外观性状和离心稳定性都较好，因此，本乳膏的乳化温度确定为75 ℃。③当搅拌速度达到200 r/min，所提供的能量不足以满足成乳的需要；当搅拌速度达到1 200 r/min时，离心稳定性差，易破乳且膏体较稀。根据实验结果，最终确定搅拌速度为800 r/min。按最优工艺制备丹皮酚泡囊乳膏，所得乳膏细腻光滑，离心稳定性好，稠度适中。

表1　工艺因素的考察结果

2.2.3制备处方的筛选通过预实验，决定选择单硬脂酸甘油酯(A)、吐温-80(B)、1，2-丙二醇(C)3种因素，按正交试验设计为3因素3水平，以L9(34)正交表进行制备处方的筛选，以外观性状、乳膏稠度为评判指标，每个实验组合平行测定2次，因素水平和实验结果见表2、表3。

表2　正交试验因素水平表

表3　L9(34)正交试验结果

表4　L9(34) 正交试验的方差分析结果

以外观性状、乳膏稠度为评判指标，由表3中极差可知各因素的影响程度为B>A>C；从表4中可以得出吐温-80对外观性状、乳膏稠度有显著影响，最优处方为A2B3C1，即实验6为最优处方。按最优处方制备丹皮酚泡囊乳膏，所得乳膏细腻光滑，离心稳定性好，稠度适中。

2.3体外透皮吸收实验

2.3.1体外鼠皮的制备取体质量为(200±20)g的雄性大鼠，用水合氯醛麻醉并用脱毛剂进行腹部脱毛，脱毛面积1 cm×1 cm，饲养24 h，处死，取下腹部皮肤，仔细剥离皮下脂肪层，置于生理盐水中，于-20 ℃冰箱中保存。

2.3.2体外透皮吸收实验方法将大鼠皮肤固定在扩散室和接受室之间，使皮肤表层面向供给室，精密称取丹皮酚乳膏置于供给室中，涂匀，并与皮肤密切接触，接受室内注入纯水，使与真皮层密切接触，排出气泡，开动恒温磁力搅拌器，保持恒温(32±0.2)℃、恒速，分别在1、2、3、5、7、9、12、24 h间隔取样0.5 mL，同时补充等容积的接受液，并排除接受室中气泡[11]。样品用0.22 μm微孔膜过滤后，取20 μL注入高效液相色谱仪，测出峰面积，代入标准曲线求出相应的药物浓度，并按下式计算累积渗透量(Q)[13]。

式中Q为t时刻药物的单位面积累积透过量(μg/cm2)；cn为t时刻浓度测量值(μg/mL)；ci为t时刻前浓度测量值(μg/mL)；x为接受室中接受液的总体积(mL)；y为每次取样容积(mL)；S为渗透面积(cm2)。

不同取样时间所测得的Q值见表5，丹皮酚原料药和泡囊乳膏的Q-T曲线见图1，丹皮酚原料药乳膏和泡囊乳膏的累积渗透性方程和渗透速率见表6。

丹皮酚原料药乳膏和泡囊乳膏中所含的丹皮酚在12 h的Q值分别是18.830 μg/cm2和21.347 μg/cm2，24 h的累积渗透量分别是30.096 μg/cm2和37.335 μg/cm2，丹皮酚泡囊的累积渗透量分别是丹皮酚原料药的1.1倍和1.2倍，透皮速率分别是1.353和1.056 μg·cm-2/h。结果表明，丹皮酚泡囊乳膏中所含的丹皮酚在相同时间内有效成分的透过量更大。

表5　丹皮酚原料药乳膏和泡囊乳膏中丹皮酚的Q值

图1　丹皮酚原料药和泡囊乳膏的Q-T曲线

样 品Q-T方程R2透皮速率/(μg·cm-2/h)丹皮酚原料药乳膏y=1.056x+5.1810.9851.056丹皮酚泡囊乳膏y=1.353x+5.4290.9911.353

2.4皮内药物滞留量的测定取样结束后，取下皮肤，拭去皮肤上制剂，甲醇中荡洗，用滤纸吸干皮肤上溶剂，立即称质量后，置于试管中，按每100 mg皮肤配伍300 μL生理盐水的比例加入生理盐水，用组织匀浆机制成乳浊液，再按乳浊液体积的3倍加入乙腈，涡旋5 min，转入LC-4016型低速离心机，4 000 r/min离心，20 min后取出，样品用0.22 μm微孔滤膜过滤，取20 μL注入高效液相色谱仪，测定其滞留量。

丹皮酚泡囊乳膏和丹皮酚原料药乳膏24 h时皮内药物滞留量分别为9.759和7.750 μg/cm2，前者是后者的1.26倍，结果表明，丹皮酚泡囊乳膏的皮内滞留量明显比丹皮酚原料药乳膏多。

3讨论

非离子表面活性剂泡囊是由合成的非离子表面活性剂与胆固醇形成的一种与脂质体类似的单室或多室封闭双层结构的有序组织聚集体[9]，与脂质体相比，毒性较低的非离子表面活性剂囊泡的载体材料不含磷脂，避免了磷脂的氧化降解，比脂质体更加稳定，可以减少药物在达到有效部位前被破坏，延长药物的半衰期，从而具有增加药效，提高生物利用度等巨大优势[8]。此外，非离子表面活性剂泡囊是在脂质体基础上发展起来的一种新型靶向给药系统，与脂质体同属微粒型给药系统，兼备脂质体的许多优点，如生物相容性、细胞亲和性、无免疫原性，且稳定性好，价格低廉，是一种极有前景的新型药物载体。非离子表面活性剂泡囊在不同的给药途径中都存在着一定的应用，但因为非离子表面活性剂泡囊与脂质体的类细胞结构相似，使其具有明显的亲脂性，可与皮肤表面融合，从而促进了药物的透皮吸收且靶向性较强；而皮肤却具有限制药物全身吸收的屏障作用，能有效减少药物的全身吸收，从而减轻药物的不良反应，因此将药物包裹入泡囊，然后做成经皮给药，体现其皮肤局部给药的优越性。

乳膏剂中药物释放穿透性较好，与油脂性机制相比更易涂布、清洗，且有保护创面、润滑皮肤和局部治疗的作用。

乳剂型基质是由水相、油相借乳化剂的作用在一定温度下乳化而成的半固体基质，可分为水包油型和油包水型两类，相对于油包水型基质，水包油型基质则更加容易清洗且水包油型基质乳膏中药物的释放和皮内渗透较快，作用时间较长，同时由于基质中水分的存在增强了润滑性而使之更加容易涂布，同时，此类制剂制备方法简便，携带方便，患者容易接受，所以本研究采用油包水型乳剂型基质。

常用的乳膏剂制备方法有研磨法、熔融法、乳化法[11]，由于乳化法制备工艺简单，且所制得的乳膏细腻均匀，因此本研究确定乳化法为丹皮酚乳膏制备方法。

制备乳膏的基本要求就是使药物在基质中分布均匀、细腻，从而保证药物的剂量与药效。因此，本研究分别通过控制变量实验、正交实验对丹皮酚乳膏的制备工艺和制备处方进行了优化。

经皮吸收制剂使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。目前测定透皮吸收的方法，多数采用薄膜扩散法，使用的扩散池以Franz扩散池居多[15]。本研究采用TP-6型透皮扩散实验仪对样品进行经皮渗透实验，以24 h累积透过量作为经皮渗透效果的评价指标。由于实验条件较难控制，且动物皮肤取样位置、皮肤处理以及药物与动物皮肤的接触情况均易影响到测定结果。为消除经皮渗透过程中以上因素带来的干扰，本组选用体质量均在500 g的雄性SD大鼠的腹部皮肤，且皮肤剥离后一定要除尽皮下脂肪，以免影响药物的经皮渗透，从而使实验结果偏低；在经皮渗透实验的过程中向扩散池中加接受液时，要保证每次补液的容积一致，并要排净气泡，以便使接受液与动物皮肤充分接触，从而减少误差。

丹皮酚原料药乳膏和泡囊乳膏中所含的丹皮酚均可以透皮，丹皮酚原料药乳膏中原料药在释放前期能快速释放，而包载于泡囊中的丹皮酚需从泡囊中扩散出来后再释放，随着时间的延长，其渗透量也随之增加，累积渗透量与时间的线性关系良好。

丹皮酚泡囊乳膏的皮内滞留量比丹皮酚原料药乳膏多，进入血液循环的药量少，从而能够达到良好的皮肤局部给药效果。

丹皮酚可抑制黑素细胞，起美白作用，但在国内外的使用并不普及；而非离子表面活性剂泡囊与皮肤表面融合性好，且可在皮内累积，因此本研究基于非离子表面活性剂囊泡的以上优点，将丹皮酚原料药制备成泡囊，再加工成乳膏剂，以期实现其抑制黑素细胞的美白作用。该制剂制备工艺简单可行，适合工业化生产，其成功研制将具有很好的市场前景。

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Preparation of Vesicle-entrapped Paeonol Cream and Evaluation of Its Percutaneous AbsorptioninVitro

HUANGTian-qing1,HERui-xi1,CHENHEJuntao1,NIEXiang-jiang1,CHENWei-dong1,2,3,4,PENGDai-yin1,2,3,WUDe-ling1,2,3,DAIMin1,2,3,4

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.SynergeticInnovationCenterofAnhuiAuthenticChineseMedicineQualityImprovement,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofTraditionalChineseMedicineResourcesProtectionandDevelopment,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 4.InnovativeTeamforStudyonModernTraditionalChineseMedicineQualityControlonScientificResearchPlatformofUniversitiesinAnhuiProvince，AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo prepare vesicle-entrapped paeonol cream, optimize the preparation process and formula of paeonol cream, and to evaluate its percutaneous absorption in vitro. MethodsThe vesicle-entrapped paeonol was prepared by the ethanol-injection method. Paeonol cream was prepared by emulsion. The preparation process and formula were optimized by variable adjustment and orthogonal design, respectively. In order to investigate the percutaneous absorption of paeonol cream in vitro, the cumulative infiltration of the cream through the abdominal skin excised from the rat on TP-6 percutaneous diffusion cell was measured by high-performance liquid chromatography. ResultsThe cumulative infiltration of the vesicle-entrapped paeonol cream within 12 and 24 hours was 1.1 and 1.2 times that of raw paeonol cream, respectively. The cutaneous retention of vesicle-entrapped paeonol cream within 24 hours was 1.26 times that of raw paeonol cream. ConclusionCompared with raw paeonol cream, vesicle-entrapped paeonol cream has higher percutaneous absorption in vitro within different periods before expiration and substantially higher cutaneous retention.

[Key words]Paeonol; Vesicle; Cream; Percutaneous absorption

基金项目:安徽省科技厅公益性技术应用研究联动计划项目(15011d04001)

作者简介：黄天擎(1994-)，女，本科生

通信作者:陈卫东，anzhongdong@126.com

[中图分类号]R944.2+1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.025

(收稿日期：2015-09-16；编辑：张倩)