针刺持续时间及刺激方案对针刺脑功能成像的影响

张　威，徐春生，李传富，刘军平，武红利

(1.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥　230031；2.安徽中医药大学医药信息工程学院，安徽 合肥　230012)

针刺持续时间及刺激方案对针刺脑功能成像的影响

张威1，徐春生1，李传富1，刘军平1，武红利2

(1.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥230031；2.安徽中医药大学医药信息工程学院，安徽 合肥230012)

[摘要]目的利用BOLD-fMRI技术，在保持其他影响因素不变的情况下研究针刺持续时间及针刺刺激方案对脑功能成像激活区定位的影响。方法选取健康志愿者40例，平均分为2组，为持续时间组及刺激方案组，第1组采用相同的针刺刺激方案(改良组块设计)进行3轮(R1、R2、R3)功能像数据采集，第2组采用3种不同的针刺刺激方案(包括典型组块、改良组块设计及事件相关设计)进行3轮功能像采集，两组数据均采用相同的MR扫描参数，用AFNI软件进行数据处理，用Monte Carlo阈值校正方法确定脑功能激活区，得出每组的组内分析结果及组内不同轮次比较的结果。 结果持续时间组及刺激方案组的组内fMRI信号存在明显差异。组内不同轮次fMRI信号比较也均存在显著差异的脑区，两组的R2与R1相比均存在fMRI信号减低区域，但刺激方案组的R3与R1相比存在广泛的fMRI信号减低区域，持续时间组的R3与R1相比存在fMRI信号增高区域。 结论针刺持续时间及刺激方案均会对脑功能成像的激活区定位产生影响。

[关键词]功能性磁共振成像；脑；针刺；刺激方案；持续时间

近年来，许多学者利用功能性磁共振成像(functional magnetic resonance imaging, fMRI)在针刺的作用机制方面得出了许多有意义的结果，但不同学者得出的结果差异很大。这其中除了针刺脑功能成像方法学非常复杂外[1]，其他因素诸如针刺感觉、期望、穴位特异性、针刺时间变异性、针刺刺激类型也会对针刺脑功能成像的激活区定位产生影响[2-6]。只有更深入地研究这些影响因素，基于脑功能成像的结果才会更加真实可靠。针刺持续时间及刺激方案，作为与针刺效应密切关联的重要影响因素，尚未得到足够的重视[7]。笔者拟通过针刺健康志愿者的双侧足三里穴(ST36)，研究针刺持续时间及针刺刺激方案对针刺脑功能成像结果的影响。笔者用电针代替手针，以尽量减少人为因素的影响，并且考虑到针刺的偏侧性，选择针刺双侧足三里穴。

1资料与方法

1.1实验对象与分组研究对象共40例，均为20～30岁的在校大学生、研究生及医护人员，在实验前均自愿签署知情同意书，无心脑血管疾病及精神疾病史，半年内未接受过针刺治疗及相关药物服用史。将实验对象随机分为2组，每组20例，分别为持续时间组及刺激方案组，持续时间组均采用相同的S1方案进行3轮(R1、R2、R3)功能像采集，刺激方案组分别按照S1、S2、S3方案的顺序进行3轮功能像数据采集，两组的MR扫描参数及电针参数均相同。

1.2实验设计根据实验内容和目标的需要，共设计3种实验设计方案，以下简称S1、S2、S3方案，见图1。①S1方案：采用改良的组块设计，先静息2 min，然后电针刺激2 min，再静息3 min，再刺激2 min，最后1 min静息，功能像采集持续10 min共150个时间点。②S2方案：采用典型的组块设计，先静息2 min，然后电针刺激2 min，再静息2 min，最后电针刺激2 min，功能像采集持续8 min共120个时间点。③S3方案：采用事件相关设计，针刺与静息交替，针刺与静息的时间按照随机化原则设定，功能像采集持续12 min 4 s，共186个时间点。

注：S1为改良组块设计，S2为典型组块设计，S3为事件相关设计；TRs代表时间点数。

图1S1、S2、S3针刺刺激方案示意图

1.3数据采集实验使用SIEMENS Symphony 1.5 T超导型磁共振扫描机，使用标准头部线圈进行7个序列的扫描。①定位像。②T2加权像：用以排除颅内病变。③第1轮任务态功能像扫描：采用回波平面成像序列(echo-planar imaging, EPI)，取与前后联合的连线平行的横轴位，重复时间(repetition time, TR)4 000 ms，回波时间(echo time, TE)50 ms，翻转角(flip angle, FA)90°，层厚3 mm，层间距0.75 mm，扫描野(field of view, FOV) 192 mm×192 mm，分辨率64×64。④2D解剖像：采用自旋回波序列T1加权序列，采用与功能像相同的扫描位置，共36层，扫描范围覆盖全脑，TR/TE/FA 500 ms/12 ms/90°，FOV 230 mm×230 mm，层厚3.0 mm，层间距0.75 mm，分辨率192×144。⑤第2轮功能像扫描：除了所选择的刺激方案不同，扫描参数与第一轮功能像一致。⑥3D解剖像：采用扰相梯度回波序列，取矢状位，共176层，TR/TE/FA 2 100 ms/3.93 ms/13°，FOV 250 mm×250 mm，层厚1.0 mm，层间距0.5 mm，分辨率256×256。⑦第3轮功能像扫描：除了所选择的刺激方案不同，扫描参数与第1轮功能像一致。

1.4实验步骤让志愿者在休息室更衣、休息，待全身放松后进入扫描室，以保持心理及生理状态的稳定；由专业的针灸科医生针刺志愿者的双侧足三里穴，进针深度约2 cm，针刺得气后，固定电针波形为连续波，频率为2 Hz，然后将针灸针通过外接导线与磁共振操作室外的华佗牌SDZ-Ⅳ型电针仪相连，设定电针电流强度以不引起受试者产生不愉快的感觉为宜，强度为1 mA。嘱受试者平躺、闭眼，用棉球塞耳，戴上专用隔音耳麦，固定头部，以最大限度限制其头动，关灯以减少视觉刺激，嘱受试者在扫描过程中保持头部静止，尽量避免心理活动，实验结束后对受试者进行反馈，记录受试者的针刺感觉信息。

1.5个体数据分析所有数据处理在安徽中医药大学第一附属医院数字化影像技术实验室完成，采用功能性神经影像分析(Analysis of Functional NeuroImages, AFNI)软件进行处理。首先去除原始功能像前4个时间点以消除扫描之初不稳定因素的影响，将剩余时间点的数据与第一个时间点对齐，然后用半高全宽(full width half maximum, FWHM)为6 mm的高斯函数对数据进行滤波，以减少空间噪声的影响；利用AFNI软件的内置程序(3Dvolreg)得到每一个数据的头动参数，剔除头动超过2 mm或旋转超过2°的数据；利用3dDetrend消除数据的低频噪声和信号漂移，最后利用3dDeconvolve计算个体统计参数图，从中提取coef值并将统计参数图转换到标准的Talairach空间。

1.6组内分析及组内不同轮次比较首先采用FWHM为5 mm的高斯函数对个体数据进行滤波，然后应用AFNI的组分析程序(3dttest++)对两组个体数据进行组内分析及组内不同轮次比较，为了消除性别、年龄及针刺感觉对实验结果的影响，分别将每一个体的性别、年龄及双侧针刺感觉(酸、麻、重、胀、行走感、疼痛；无=0，有=1)作为协变量，然后进行Monte Carlo阈值校正，P=0.01，用3dClustSim程序算出α≤0.05的最小数据簇大小。采用单样本t检验对两组各3轮功能像扫描数据进行组内分析，采用配对样本t检验对每一组间3轮扫描(R2vsR1，R3vsR2，R3vsR1)进行组内不同轮次比较，显示激活区，统计并记录激活区的位置。

2结果

2.1病例剔除情况刺激方案组有2例头部移动超过标准，未纳入统计结果，剩余18例(男7例，女11例，平均年龄24.5岁)满足实验要求；持续时间组也有2例头部移动超过标准，剩余18例(男6例，女12例，平均年龄23.0岁)满足实验要求，纳入最终的实验结果。

2.2组内fMRI信号比较组内分析结果显示，大脑对每一组各3轮刺激的反应是不同的。在R1，两组均观察到fMRI信号增高脑区；在R2，两组观察到fMRI信号减低脑区；在R3，持续时间组显示广泛的信号增高脑区，而刺激方案组显示广泛的fMRI信号减低脑区。见表1、图2。

2.3组内不同轮次fMRI信号比较持续时间组和刺激方案组每组内3轮之间fMRI信号两两比较，均存在差异具有统计学意义的脑区。刺激方案组R3与R1、R3与R2相比存在fMRI信号减低脑区；持续时间组R2与R1相比存在fMRI信号减低脑区，与刺激方案组不同的是，持续时间组R3与R1相比存在fMRI信号增强脑区。见表2、图3。

3讨论

大量的文献报道了针刺可以引起特定脑区及脑功能网络的激活，并且研究了不同的影响因素对针刺fMRI结果的影响。本研究关注针刺刺激本身，即针刺持续时间及针刺刺激方案对针刺fMRI脑功能激活区定位的影响。

表1　持续时间组和刺激方案组组内fMRI信号比较

注：P=0.01，α≤0.05，簇数=20，Z值>0代表信号增高区域，Z值<0代表信号减低区域；BA为布鲁德曼分区(Brodmann area)，括号中数字表示布鲁德曼分区中激活脑区的位置。

3.1针刺持续时间对脑功能激活区定位的影响针刺累积效应，也称作针刺的后效应、持续效应或延迟效应，已经被许多文献[5，8-10]所报道。基于典型组块设计和一般线性分析模型的脑功能激活区，可能会受到针刺累积效应的影响[11]。基于同样的组块设计、扫描参数及数据处理方法，持续时间组组内分析结果显示3轮fMRI信号均是不同的，而且3轮fMRI信号之间两两比较均存在差异性脑区，但是第2轮扫描和第1轮扫描相比存在信号减低区域。本研究结果和国外Yeo等[12]的研究结果相似，在他们的研究中，也是采用了相同的刺激方案连续采集了两次功能像数据，第2次扫描也显示信号减低区域。与之不同的是本组扫描时间足够长，并且在3轮功能像之间分别扫描了2D和3D解剖数据。考虑到短时程的刺激不能完全模拟临床长时间针刺产生的效应[13]，本研究采用了足够长的时间证明是否存在针刺持续效应。组内分析结果显示第3轮刺激显示了更多激活的脑区，并且和第1轮、第2轮扫描结果相比出现更多的信号增高脑区。这些结果提示，即便采用相同的针刺刺激模式，采用同样的数据处理方法进行后处理，不同的针刺持续时间也会影响大脑对针刺的反应。综上所述，在针刺脑功能成像的研究方面应该考虑到针刺的持续时间及时间变异性对研究结果的影响。

3.2针刺刺激方案对脑功能激活区定位的影响为了证明大脑对针刺的反应到底受到哪些因素的影响，许多学者做了大量的研究，但是针刺刺激方案作为针刺脑功能成像实验设计的重要环节之一，尚未得到足够的重视[7]。在针刺脑功能成像的研究中，最常用的针刺刺激方案包括典型组块设计、改良组块设计和事件相关设计。在典型组块设计中，一个序列是由若干个具有等间距的刺激和静息组块组成的，但其缺点在于刺激比较规则，被试者可能因此产生期望效应和习惯化效应[14]等，因此无法完全模拟临床针灸的实践操作。在改良组块设计中，是由许多不等间距的组块所组成，但其缺点同样在于规律相对比较规则。Qin等[15]提出的非重复事件相关设计，也就是单组块后长时间静息的刺激模式，这种模式因太过简单而无法适应临床及实验的需要。总之，在临床中用到的针刺刺激方案和针刺脑功能实验中用到的方案相比更加不规则及随机化，因此本研究设计了一个由若干刺激和静息时间均不等的不规则组块组成的事件相关设计。

首先，从组内分析结果可以看出，刺激方案组的第3轮刺激显示广泛的信号减低脑区，而持续时间组的第3轮刺激显示的是广泛的信号增高脑区；其次，刺激方案组的组内不同轮次fMRI信号比较结果显示激活强度是按照扫描方案的顺序逐渐减弱的，但持续时间组与之相反。通过分析刺激方案组第3轮扫描的结果，发现这些激活的脑区与大多数文献报道的针刺激活脑区基本一致，包括岛叶、第二躯体感觉区(SⅡ)、中扣带回和小脑等一些体感区，但本研究中这些区域均是信号减低区域而不是文献报道的信号增高区域[16]。这些结果提示不同的针刺刺激方案均会影响大脑对针刺的反应，尽管尚不能确定事件相关设计必然优于组块设计，但至少可以说明不同的刺激模式会影响针刺脑功能激活区的定位，在以后的针刺脑功能成像的研究中必须考虑针刺刺激方案的影响。

3.3不足与总结本研究利用BOLD-fMRI技术，初步证实针刺持续时间及针刺刺激方案都会对脑功能成像的激活区定位产生影响，但本研究仍然存在一些不足之处。首先，在持续时间组，为了证明每一轮扫描激活区的不同是由针刺的累积效应引起的，最好增加常规任务作为对照组，如手指运动或视觉刺激，这些任务理论上与针刺得到的结果类似。其次，尽管在数据处理过程中考虑到针刺的感觉，并将之作为协变量加以去除，但也不能完全保证这种差异不是由针刺的感觉所导致的，因为最后统计的针刺感觉只是受试者在整体实验过程中的针刺感觉，而针刺的感觉在实验的过程中是动态变化的[17]。最后，有学者[18]报道了一般线性分析方法不太适合检测针刺引起的神经生理反应，而本研究结果也有可能受到方法学的影响，在以后的研究中宜应用新的数据分析方法以减少方法学对实验结果的影响。

图2　持续时间组和刺激方案组组内fMRI信号比较

组 别组内轮次比较激活脑区(BA)偏侧Z峰值Talairach坐标X峰值Y峰值Z峰值体素持续时间R2vsR1颞中回(39)左-4.2537.561.526.535楔前叶(7)左-3.544.546.547.526R3vsR1小脑第Ⅶa小叶右3.85-25.576.5-36.5101小脑第Ⅸ小叶右3.97-13.552.5-51.586小脑第Ⅶa小叶左3.8928.567.5-27.549脑干左3.977.522.5-42.541小脑第Ⅶa小叶左3.7213.579.5-27.539前扣带回(32)右3.85-1.5-43.58.538额中回(6)右3.96-28.5-7.556.533小脑山顶右3.64-13.528.5-18.522R3vsR2小脑第Ⅶa小叶右4.11-40.546.5-33.5238额下回(47)左3.8837.5-25.5-12.565颞中回(21)右4.23-49.5-1.5-21.554颞中回(37)右3.85-55.546.5-3.554额中回(10)左3.7637.5-52.511.543小脑第Ⅷb小叶右3.12-7.540.5-45.539额中回(46)右4.11-46.5-19.526.532枕中回(18)右3.98-28.582.5-9.530颞中回(22)右3.78-64.540.52.524额下回(44)右3.27-52.5-7.523.522额中回(8)左3.3025.5-22.541.521前扣带回(25)左3.364.51.5-3.520额中回(9)右3.82-22.5-37.535.520刺激方案R2vsR1小脑第Ⅷa小叶右-4.04-10.570.5-33.533小脑山顶左-3.6722.531.5-27.529颞下回(20)左-3.3352.525.5-21.526小脑第Ⅵ小叶右-3.25-10.558.5-3.525R3vsR1中央旁小叶(31)左-4.384.519.544.5188颞上回(22)左-4.3061.57.52.5139小脑第Ⅶb小叶右-4.10-10.567.5-24.582额中回(6)右-3.80-28.54.559.545额下回(47)右-3.73-52.5-19.5-3.542罗兰迪克岛盖(41)右-3.49-43.525.514.540楔前叶(7)右-3.86-1.558.559.540小脑第Ⅵ小叶右-3.29-19.558.5-15.528颞中回(21)左-3.6858.519.5-12.521R3vsR2中央旁小叶(6)右-4.10-7.519.553.550岛叶(13)右-4.37-40.57.5-3.540舌回(19)右3.9919.561.55.532后扣带回(30)右3.56-7.567.511.531小脑第Ⅵ小叶左3.5634.552.5-24.528

注：P=0.01，α≤0.05，簇数=20，Z值>0代表信号增高区域，Z值<0代表信号减低区域；BA为布鲁德曼分区(Brodmann area)，括号中数字表示布鲁德曼分区中激活脑区的位置。

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图3　持续时间组和刺激方案组组内不同轮次fMRI信号比较

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Influence of Duration and Stimulation Protocol of Acupuncture on Brain Functional Imaging

ZHANGWei1,XUChun-sheng1,LIChuan-fu1,LIUJun-ping1,WUHong-li2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.InstituteofMedicalInformationEngineering,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of duration and stimulation protocol of acupuncture on localization of the active region in brain functional imaging with other influencing factors remaining the same using blood oxygenation level dependent-functional magnetic resonance imaging (BOLD-fMRI). MethodsA total of 40 healthy volunteers were enrolled and equally divided into duration group and stimulation protocol group. The duration group received three runs (R1, R2, and R3) of collection of functional imaging data with the same stimulation protocol (modified block design), and the stimulation protocol group received three runs of collection of functional imaging data with different stimulation protocols (typical block design, modified block design, and event-related design). The same MR scanning parameters were applied for the two groups. AFNI software was used for data analysis, and the Monte Carlo threshold correction method was used to determine the active region of brain function and to obtain the results of intra-group analysis and comparison between different runs within each group. ResultsThe fMRI signal showed significant differences within the duration group or the stimulation protocol group. There were brain regions where fMRI signal was significantly different across these runs. In both groups, there were brain regions where fMRI signal decreased from R1 to R2. There were extensive brain regions where fMRI signal decreased from R1 to R3 in the stimulation protocol group, while there were brain regions where fMRI signal increased from R1 to R3 in the duration group. ConclusionDuration and stimulation protocol of acupuncture influence the localization of active regions in bran functional imaging.

[Key words]Functional magnetic resonance imaging; Brain; Acupuncture; Stimulation protocol; Duration

基金项目：国家“973”计划项目(2010CB530505)；安徽省教育厅重大科研项目(KJ2011ZD05)

作者简介：张威(1986-)，男，住院医师

通信作者：李传富，lcf_1966@126.com

[中图分类号]R245；R445.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.020

(收稿日期：2016-01-12；编辑：姚实林)