人参皂苷20(R)-25-OH-Rg3的分离纯化及结构鉴定

杨 佳 美，　刘 春 莹，　金 凤 燮，　鱼 红 闪

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )

人参皂苷20(R)-25-OH-Rg3的分离纯化及结构鉴定

杨 佳 美，刘 春 莹，金 凤 燮，鱼 红 闪

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:采用硅胶柱层析法和结晶法，从人参皂苷酶转化产物中分离得到了一种未知人参皂苷，并对其结构进行分析。10 g人参皂苷酶转化产物，分离纯化得到该人参皂苷单体0.25 g。经HPLC检测，其纯度达99.7%。核磁共振检测结果表明，该人参皂苷单体为12β，20(R)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，命名为20(R)-25-OH-Rg3。

关键词:人参皂苷；分离纯化；结构鉴定

0引言

人参皂苷是人参中的主要有效成分，在人参主根中的质量分数为4%左右[1-2]。现已明确的人参皂苷单体有60多种[3]。人参皂苷由疏水的非糖基皂苷元(Aglycon)和亲水的糖(Sugarmoieties)两部分组成[4]。人参皂苷属于三萜类皂苷，可分为3类：原人参二醇类皂苷(PPD)，原人参三醇类皂苷(PPT)和齐果烷类人参皂苷[5]。人参皂苷具有广泛的生物学活性[6-7]。

本实验室前期利用酶转化法制备了二醇类人参皂苷产物，对该产物进行HPLC检测，与实验室现有标准品(Rg3、F2、Rg5、Rh2、C-K等)对照，发现其中有一种未知人参皂苷，采用硅胶柱层析法及结晶法对该未知皂苷进行分离纯化，得到目的皂苷单体，并利用核磁共振技术对单体结构进行鉴定。

1材料与方法

1.1材料

人参皂苷酶转化产物，实验室自制；人参皂苷标准品Rb1、Rc、Rd、F2、Rg3、Rg5、C-K、Rh2，本实验室提供；薄层层析板SilicaGel60-F254，德国Merck公司；硅胶，青岛海洋化工厂；甲醇、氯仿，均为分析纯。

JascoN2000系列高效液相色谱仪，日本分光公司；Alltech2000ES型蒸发光散射检测器，美国Alltech公司；瑞士BrukeAVANCE600核磁共振波谱仪。

1.2方法

1.2.1薄层层析

将人参皂苷溶于甲醇中，点样于薄层层析板，展开剂为体积比7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水混合物，显色剂为10%硫酸溶液。通过对照样品斑点与标准品斑点来确定样品中所含皂苷成分。

1.2.2硅胶柱层析

取10g人参皂苷产物，用少量甲醇溶解(不能溶解的样品用氯仿溶解)，称取25g的80～100目硅胶，加入样品溶液中，并均匀搅拌待其完全蒸干[8]。称取200g的300～400目硅胶作为分离胶，再装入样品胶，在最上层放置脱脂棉。用一定量的纯氯仿通柱，然后按氯仿-甲醇体积比9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5依次进行洗脱。每200mL收集一瓶，并用TLC法检测。

1.2.3高效液相色谱

采用HPLC-蒸发光散射检测器检测人参皂苷[9]，将样品的保留时间与人参皂苷标准品的保留时间进行比对，以确定人参皂苷的种类。中汇达C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；进样量，10μL；柱温，35 ℃；流动相流量，1.0mL/min；载气，氮气；气体体积流量，3.2L/min；载气压力，0.1MPa；ELSD的漂移管温度，110 ℃。

流动相：乙腈(A)-水(B)；0～20min，20%A；20～31min，20%～32%A；31～40min，32%～43%A；40～70min，43%～100%A。

1.2.4核磁共振法

利用瑞士BrukeAVANCE600超导核磁共振波普仪对单体皂苷进行一维核磁共振检测。1H观测频率为400MHz，13C观测频率为150MHz，溶剂是Pyridine-D5(氘代吡啶)。包括1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、DEPT45、DEPT90、DEPT135、HSQC、HMBC等图谱的测定。

2结果与讨论

2.1人参皂苷产物成分的确定

取少量人参皂苷产物溶解于甲醇溶液中，经HPLC检测，结果如图1所示。

图1　人参皂苷产物的HPLC检测图谱

与实验室标准品对照，可知该产物中主要含有(S，R)-Rg3、Rg5及一种未知皂苷，未知皂苷中有2个吸收峰，暂命名为化合物1和化合物2。

2.2硅胶柱层析法分离未知皂苷

按照“1.2.2”的方法对该未知人参皂苷进行硅胶柱分离。收集洗脱液，TLC检测结果如图2所示。

图2　样品的TLC图谱

利用硅胶柱层析法分离目的皂苷，根据TLC检测结果，分别收集较纯的各组分，收集的情况如表1所示。

表1　洗脱分离收集表

经过硅胶柱层析法的分离，得到3种较纯的人参皂苷，分别是目的皂苷、Rg3和Rg5。其中目的皂苷为1.42g，得率是14.2%。采用TLC法对表1中的各组分进行测定，结果如图3所示。

原，人参皂苷混合物；1～3分别为收集的未知皂苷、Rg3和Rg5

图3硅胶柱洗脱单点组分TLC图

Fig.3TLCofpurefractionsfromsilicagel

由图3可以看出，3种组分在TLC板中均为单点。采用HPLC法检测目的皂苷的纯度，结果如图4所示。由图4可知，虽然目的皂苷在TLC上呈现单点，但是在HPLC图谱中显示出2个吸收峰，说明硅胶柱层析法不能将这两种化合物分离，需要对化合物1和化合物2进行进一步的精制。

图4　目的皂苷的HPLC图谱

2.3结晶法纯化化合物2

将硅胶柱分离得到的化合物1和化合物2混合物，溶解于20mL70%的甲醇溶液中，自然冷却结晶，放置2～3d后，得到白色不定型沉淀物，过滤后收集沉淀。HPLC检测结果如图5所示，该晶体的保留时间是45.290min，与图4中2个峰的保留时间作对比可以看出，析出的结晶为化合物2，质量为0.25g，得率是17.6%，纯度达99.7%。

图5　化合物2的HPLC图谱

2.4核磁法测定化合物2的结构

对化合物2进行1HNMR，13CNMR，1H-1HCOSY，DEPT45，DEPT90，DEPT135，HSQC，HMBC等检测。得到1HNMR(吡啶-d5，400MHz) 数据：0.718(3H，s，H-19)，0.831(3H，s，H-30)，0.904(3H，s，H-18)，1.001(3H，s，H-29)，1.187(3H，s，H-28)，1.305(9H，s，H-21，26，27)，5.25(1H，d，J=7.8Hz，H-1′)，4.82(1H，d，J=7.8Hz，H-1″)；其13CNMR数据如表2所示。

结合1HNMR和13CNMR数据，发现化合物2的碳谱数据与文献[10]中12β，20(R)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside的数据非常相似，应该是同种物质，结构式如图6所示。其分子式为C42H74O14，相对分子质量为803.03。该物质的简称为25-OH-Rg3[11](也称作Rg3-Hy[12])，由于本次分离出的结构为R型25-OH-Rg3，所以命名为20(R)-25-OH-Rg3。

表2　化合物2的13C-NMR化学位移

图6　20(R)-25-OH-Rg3的结构式

人参皂苷20(R)-25-OH-Rg3具有很高的药用价值，它能增加大脑中的Na+通量进而增强记忆能力[17]，而且能抑制肿瘤细胞的生长[18]。

化合物1的纯化未达到核磁要求，未对其进行核磁检测。根据HPLC及此次核磁检测结果分析，推测化合物1和化合物2可能是手性化合物，化合物1可能是S型的25-OH-Rg3，其系统名称是12β，20(S)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，结构式如图7所示。

图7　20(S)-25-OH-Rg3的结构式

3结论

该酶转化产物中主要含有(S，R)-Rg3、Rg5及人参皂苷(S，R)-25-OH-Rg3。10g人参皂苷产物进行硅胶柱层析法的分离，得到目的皂苷1.42g，得率为14.2%。结晶法制得20(R)-25-OH-Rg3单体0.25g，得率为17.6%，HPLC检测其纯度达99.7%。经核磁共振分析可知，人参皂苷20(R)-25-OH-Rg3的系统命名为12β，20(R)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，其分子式为C42H74O14，相对分子质量为803.03。另外，推测化合物1可能是S型的25-OH-Rg3，其系统名称是12β，20(S)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

目前，国内外文献中关于20(R)-25-OH-Rg3的报道很少，鉴定出(S，R)-25-OH-Rg3的结构，不仅丰富了人参皂苷的种类，还为其更多的生物活性研究提供理论依据。

参考文献:

[1] 郑长龙,鱼红闪,金凤燮.人参稀有皂苷C-K的分离与纯化[J].大连工业大学学报,2003,22(3):167-169.

[2] 杨金祥,章建芳,郑波,等.人参皂苷Rh2抗肿瘤作用研究进展[J].药学进展,2007,10(3):236-237.

[3] 孟祥颖,任跃英,李向高,等.西洋参中皂苷成分的研究综述[J].特产研究,2001(3):43-46.

[4] 唐斌,程绪菊,刘江,等.人参皂苷药理作用研究进展[J].西南军医,2005,7(3):45-47.

[5]YUHS,ZHANGCZ,LUMC,etal.Purificationandcharacterizationofnewspecialginsenosidasehydrolyzingmulti-glycisidesofprotopanaxadiolginsenosides,ginsenosidasetypeⅠ[J].ChemicalandPharmaceuticalBulletin, 2007, 55(2): 231-235.

[6] 王笳,袁崇均,陈帅,等.从西洋参中提取分离纯化人参皂苷Rb1和人参皂苷Re的研究[J].天然产物研究与开发,2008,20(2):357-359.

[7] 窦德强,靳玲,陈杰英.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望[J].沈阳药科大学学报,1999,16(2):15-16.

[8] 李鹏飞,何丹,鱼红闪,等.人参皂苷Rf的分离提纯[J].大连工业大学学报,2011,30(3):180-182.

[9] 蔡艳,郭文盛.HPLC-ELSD测定西洋参中人参皂苷含量[J].陕西中医学院学报,2009,32(1):64-65.

[10]CHENGT,YANGM,SONGY,etal.MicrobialtransformationofginsenosideRb1byAcremoniumstrictum[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2008, 77(6): 1345-1350.

[11]LEEJH,CHOISH,LEEBH,etal.Modificationsofaliphaticsidechainof20(S)-ginsenosideRg3causeanenhancementorlossofbrainNa+channelcurrentinhibitions[J].BiologicalandPharmaceuticalBulletin, 2008, 31(3): 480-486.

[12]WANGJR,LEEFY,ZHANGR,etal.Transformationofginsenosidesfromnotoginsengbyartificialgastricjuicecanincreasecytotoxicitytowardcancercells[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 2014, 62(12): 2558-2573.

Purificationandidentificationof20(R)-25-hydroxy-ginsenosideRg3

YANGJiamei,LIUChunying,JINFengxie,YUHongshan

(SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Abstract:A rare ginsenoside was purified from the biotransformation products of natural ginsenosides. 0.25 g rare ginsenoside was obtained from 10 g samples after silica gel chromatograph and crystalliza- tion, and its purity was 99.7% detected by HPLC. NMR result showed that the rare ginsenoside was 12β, 20(R), 25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside, named 20(R)-25-hydroxy-ginsenoside Rg3.

Key words:ginsenoside; purification; identification

收稿日期:2014-12-30.

基金项目:“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003).

作者简介:杨佳美(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

中图分类号:TS201.2；Q946.83

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)03-0171-03