1株人兽鱼共患病原菌嗜水气单胞菌的分离鉴定

毕建飞，康元环，陈亨利，张海月，张冬星，姜剑峰，单晓枫，钱爱东（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）



1株人兽鱼共患病原菌嗜水气单胞菌的分离鉴定

毕建飞，康元环，陈亨利，张海月，张冬星，姜剑峰，单晓枫，钱爱东
（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）

摘要：为了对长春市某养鱼场病死鱼致病菌进行分离鉴定，对分离菌株进行了生物学特性分析，16S rRNA和3种管家基因的序列测定与分析，并对其进行鲤鱼、昆明系小鼠致病性试验及药敏试验。结果显示，该细菌为革兰阴性杆菌，培养特性、理化反应与嗜水气单胞菌基本相同；对左氧氟沙星、卡那霉素等18种抗菌药物敏感，万古霉素、苯唑西林等4种抗菌药物耐药；16S rRNA和dnaJ、rpoD、gyrB管家基因的均与GenBank上的嗜水气单胞菌相应基因有较高的同源性，同源性最高分别为99.6%、97.9%、99.9%。分离菌株对鲤鱼、昆明系小鼠有较强的致病作用，其半数致死量分别为6.76×107CFU/只、1.39×106CFU/只，表明该菌可能是1株人兽鱼共患病原菌。

关键词：嗜水气单胞菌；管家基因；系统发育分析；药敏试验

气单胞菌广泛存在于自然环境中，具有广泛的致病性，能够感染包括鲢、鳙、白鲫、团头鲂、草鱼、鲟鱼、鲤鱼等多种鱼类，导致败血症或皮肤溃疡等症状，是鱼类最常见的致病菌。人食用了污染的蔬菜、水产品和畜禽产品后，可引发腹泻、脑膜炎和败血症等，免疫力低下的患者甚至可能死亡［1］。本文从吉林省长春市某养鱼场病死鲤鱼病变组织分离获得1株致病菌，经致病性试验，其对鲤鱼与昆明系小鼠均有较强的致病性，通过生物学特性观察、16S rRNA基因和3个具有代表性的管家基因dnaJ、rpoD和gyrB的鉴定显示其为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。同时通过药敏试验对该致病菌的敏感药物进行了筛选，为该病的确诊与防治提供了依据和参考。

1　材料与方法

1.1材料取自吉林省长春市某养鱼场病鱼。

1.2主要试剂RS鉴别培养基、营养肉汤、营养琼脂，购自北京陆桥生物技术有限责任公司；细菌微量生化反应管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；DL-2 000 Marker、Taq DNA聚合酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.3试验动物供感染试验鱼为健康鲤鱼，体重约80 g～90 g。昆明系小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重为20 g～25 g。

1.4病原菌分离无菌操作直接从肝脏组织样进行琼脂平板划线分离，所用培养基为普通营养琼脂培养基，分别置于有氧和厌氧环境下30℃恒温培养24 h～48 h，挑取占优势形态一致的单个菌落进行纯化培养，纯化后的细菌用作感染和生理生化与分子鉴定。

1.5人工回归感染试验选取健康鲤鱼，体重80 g～90 g，参考邓国成等的方法［2］进行人工回归感染试验。

1.6致病菌的鉴定

1.6.1常规生化鉴定纯化后的细菌30℃培养24 h后做革兰染色。按照微量生化反应管说明书鉴定菌株的生化特性。

1.6.2 16S rRNA及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB序列测定及系统发育分析采用菌落热裂解法制备PCR模板，引物目标基因dnaJ，dnaJF：5′-CGAGATCAAGAAGGCGTACAAG-3′，dnaJR3：5′-CACCACCTTGCACATCAGATC-3′；目标基因rpoD，rpoD70-F*：5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3′，rpoD70R*：5′-ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYTT-3′；目标基因gyrB，gyrB 3F：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′，gyrB 14R：5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′；目标基因16S rRNA，27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′，1411R：5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTA-3′。PCR反应程序参考文献［3］。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果与GenBank中登录的相关序列进行相似性分析，并通过Blast程序多重比对，用Mega6.0软件采用邻接法进行聚类分析，并构建系统进化树。

1.7致病性试验

1.7.1鲤鱼致病性试验菌落计数法调整菌悬液浓度3.4×108CFU/mL～3.4×106CFU/mL，然后为鲤鱼进行胸鳍基部注射，每尾注射0.2 mL菌悬液，对照组注射相同剂量的无菌生理盐水，每组10条鲤鱼。记录每组鲤鱼死亡情况，改良寇氏法计算半数致死量。

1.7.2昆明系小鼠致病性试验调整菌悬液浓度1.75×108CFU/mL～1.75×104CFU/mL，10倍稀释，各稀释度以0.2 mL/只腹腔注射昆明系小鼠，对照组注射0.2 mL/只无菌生理盐水，每组5只小鼠。观察小鼠症状，剖检死亡小鼠，并从其肝脏、肾脏等部位再次分离细菌，进行菌体形态观察和生理生化鉴定。改良寇氏法计算半数致死量。

1.8药物敏感性试验采用纸片法，将纯化培养24 h的细菌，均匀涂布于普通营养琼脂平板上，同时粘贴药敏纸片，培养24 h后观察并记录抑菌圈直径，药敏试纸购自北京天坛药物生物技术开发公司。

2　结果

2.1病原菌分离从病鱼样品中分离得到1株优势菌株，暂时命名为JL1021。菌株在普通营养琼脂培养基上生长良好，兼性厌氧，形成边缘整齐、表面湿润、光滑的圆形菌落，菌落呈现半透明、灰白色至呈肉色略带淡黄色不等，有特殊气味。革兰染色后，油镜下观察，为革兰阴性菌，形状大多呈短杆状，略呈弧状，两端钝圆，单个分散排列。经生理生化鉴定，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》初步判定菌株为嗜水气单胞菌。

2.2细菌人工回归感染试验结果人工回归感染试验表明，菌株JL1021对鲤鱼具有致病作用，试验鱼发病和死亡症状与自然病症基本相同。而且从人工感染的病鱼的肝、肾等组织和腹腔内积水中又可分离到与试验菌株形态特征、理化特性一致的菌株，表明菌JL1021是鲤鱼细菌性败血综合征的致病菌。

2.3致病性试验结果

2.3.1鲤鱼致病性试验结果菌株JL1021人工感染的鱼也呈现体表溃烂、腹腔积有大量腹水、眼睛四周充血突出和烂鳃等症状，而且从人工感染的病鱼的肝、肾等组织和腹腔内积液中又可分离到与试验菌株形态特征、理化特性一致的菌株。改良寇氏法计算菌株对鲤鱼的LD50为6.76×107CFU/只。

2.3.2昆明系小鼠致病性试验结果菌株对昆明系小鼠有明显的致病性，1 d～2 d内死亡，剖检可见肝脏和肺出血严重，肾脏肿大。进行病原分离培养，能够分离到与JL1021形态和生理生化特征一致的菌株。改良寇氏法计算菌株对昆明系小鼠的LD50为1.39×106CFU/只。

2.4菌株16S rRNA基因以及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB序列测定及系统发育分析菌株16S rRNA基因以及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB基因PCR扩增，进行1%琼脂糖凝胶电泳（图2）。采用Mega6.0软件构建系统进化树（图2-图5）。菌株JL1021在系统发育树中与A.hydrophila位于同一进化分支。经Mega6.0软件计算，分离株与A. hydrophila的模式菌株同源性为99.9%。本研究对分离株JL1021的16S rRNA基因以及管家基因dnaJ、rpoD、gyrB进行序列测定及系统发育分析，均与A. hydrophila位于同一发育分支。

图1　16S RNA基因以及管家基因gyrB；rpoD；dnaJ基因的PCR扩增M：Marker DL-2 000；1：16sRNA；2：gyrB；3：rpoD；4：dnaJ

图2　根据16s rRNA基因构建的系统发育树

图3　根据dnaJ基因构建的系统发育树

2.5药敏试验结果经以22种抗菌类药物对JL1021进行药敏测定，结果表明，该分离株对左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、磺胺甲基异噁唑、复方新诺明、头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、米诺环素、卡那霉素、克拉霉素、呋喃妥因、四环素、氟苯尼考、氯霉素、多粘菌素B、大观霉素、罗红霉素18种药物敏感；对杆菌肽、万古霉素、萘啶酸、苯唑西林4种药物耐药。

图4　根据rpoD基因构建的系统发育树

图5　根据gyrB基因构建的系统发育树

3　讨论

嗜水气单胞菌对淡水鱼类具有很强的致病性，病鱼主要以出血、腹水和烂鳃等症状为主，且近年来由嗜水气单胞菌引发的淡水鱼暴发性出血病有增多的趋势。除感染鲤鱼外，嗜水气单胞菌也可感染其他养殖鱼类及水生动物［4-5］。此外，本试验也证实该菌株对昆明系小鼠也具有一定的致病性，暗示其可能是1株人兽鱼共患病原菌。

16S rRNA基因序列的测定分析已成为细菌分类研究的金标准，被用于细菌属水平的分析，但对亲缘关系比较近的种分辨率不高，往往需采用其他方法补充鉴定。因此国际细菌分类委员会建议对染色体不同位点、单拷贝形式存在的管家基因进行序列分析，寻找合适的序列相似性水平用于种群的确定［6］。本研究利用dnaJ、gyrB和rpoD 3个管家基因对所分离的菌株进行系统发育分析，结果显示，各管家基因具有良好的一致性，且与16S rRNA基因序列结果相符。

关于嗜水气单胞菌对抗生素敏感性的试验，已有不少报道，，但各地分离菌株耐药状况因时间、来源不同而存在一定差异［7-9］，本试验的结果也证实了这点；此外，，本研究分离的嗜水气单胞菌对左氧氟沙星、罗红霉素、卡那霉素等高度敏感，结合临床上选择治疗药物的相关原则，可以选用兽用左氧氟沙星进行治疗。

参考文献：

［1］Fraisse T，Lechiche C，Sotto A，et al.Aeromonas spp. infections: retrospective study in Nimes university hospital，1997-2004［J］. Pathol Biol，2008，56（2）：70-76.

［2］邓国成，江小燕，叶星，等.草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离，鉴定与理化特性［J］.微生物学通报，2009，36 （8）：1170-1177

［3］李伟杰，赵耘，刘燕，等.狐狸源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析［J］.中国预防兽医学报，2012，34（4）：289-292.

［4］孙承文，任燕，石存斌，等.鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离，鉴定［J］.广东农业科学，2010，9（5）：921.

［5］刘亚楠，梁利国，顾伟，等.异育银鲫致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与药敏特性研究［J］.水生态学杂志，2012，33（5）：108-113.

［6］Stackebrandt E，Frederiksen W . Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology［J］. Int J Syst Bacteriol，2002，52：1043-1047.

［7］Vivekanandhan G，Savithamani K，Hatha A A M，et al.Antibiotic resistance of Aeromonas hydrophi laisolated form marketed fish and prawn of South India［J］.International Journal of Food Mi crobiology，2002，76（1-2）：165-168 .

［8］童照威，张龙琪，王伟洪，等.嗜水气单胞菌感染现状及耐药分析［J］.中国微生态学杂志，2008，20（1）：75-76.

［9］宋铁英，陈强，郑在予，等.不同来源嗜水气单胞菌的抗菌素耐药性及耐药机制分析［J］.福建农业学报，2008，23（2）：119-124 .

Isolation and identification of man- animal- fish Pathogenic Aeromonas hydrophila

BI Jian-fei，KANG Yuan-huan，CHEN Heng-li，ZHANG Hai-yue，
ZHANG Dong-xing，JIANG Jian-feng，SHAN Xiao-feng，QIAN Ai-dong
（College of animal science and technology，jilin agricultural university，Changchun 130118，China）

Abstract：In order to identify a bacteria isolated from fish tissue in a fish farm，we used the phylogenetic strategy，the morphology，physical and chemical characteristics，16S rRNA sequence analysis，pathogenicity，and drug sensitivity test.The results showed that the bacteria isolate was gram-negative and the culture，physical and chemical characteristics were identical with Aeromonas hydrophila，except sucrose and acetate reaction .The drug sensitivity test revealed that the isolate was sensitive to 18 kinds of drugs such as Ofloxacin，and kanamycin，and was resistant to 4 kinds of drugs such as Penicillin G，ampicillin.In additionally，phylogenetic analysis based on 16S rRNA also indicated that the isolate was clustered in the genus Aeromonas，with the highest similarity to Aeromonas hydrophila.Artificial infection test showed that the isolate was pathogenic to Carp，and Kunming mice with a LD50of 6.76ici7CFU，and 1.39 ici6CFU，respectively.And the results also revealed that the bacteria could be a man-animalfish zoonotic pathogen.

Key words：Aeromonas hydrophila；housekeeping gene；phylogenetic analysis；drug sensitivity test Corresponding authors：QIAN Ai-dong；SHAN Xiao-feng

中图分类号：S941

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0118- 03

收稿日期：2015-05-29

基金项目：国家自然科学基金项目（31201927）；吉林省重点科技攻关项目（20150204065NY）

作者简介：毕建飞（1990-），男，硕士生，从事动物微生物学研究，E-mail：jianfeibi@163.com

通讯作者：钱爱东，E-mail：qianaidong0115@163.com；单晓枫，E-mail：sxf1997@163.com