适用于多细胞共培养的培养孔板的研制

谢一泓，黎丹戎



适用于多细胞共培养的培养孔板的研制

谢一泓，黎丹戎

作者单位：122000 辽宁，朝阳市中心医院肿瘤内科（谢一泓）；530021南宁，广西医科大学附属肿瘤医学院（黎丹戎）

细胞微环境即细胞生长所处的内环境，由多因素组成，对细胞的生物学特性和功能起重要作用，不仅影响细胞的正常生理过程，也影响细胞的病理过程。

体外细胞培养是进行基础研究、药物研发的重要途径，但单一细胞培养与体内环境相差很大［1-2］，因此会影响细胞的生长状态、功能特性等，使体内外研究结果不一致。细胞共培养即将不同种类细胞混合共同培养，主要有两种方法：直接共培养和间接共培养。直接共培养体系［3］是将 2 种或2 种以上的细胞按一定比例同时接种于同一培养器材内，不同类型的细胞之间直接接触培养。间接共培养体系，即将2 种或 2 种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，即不同种类的细胞共用同一种培养系统而不直接接触，如 Transwell 小室共培养皿［4］。

现有的共培养技术存在一定的不足及局限性，直接共培养体系的多种细胞培养后无法分离进行后续研究，不能满足实验需求。间接共培养体如 Transwell 共培养系统，只能进行两种细胞共培养，无法实现多细胞共培养，且两种细胞中有一种生长在膜上，进行后续实验不便。为使体外研究能够更好地反映体内情况，满足实验需求，研制适用于多细胞共培养孔板成为当务之急。该孔板有利于细胞间信号传递和细胞因子相互作用，为细胞的生长及生物学功能的发挥提供适宜的微环境，可更加准确模拟体内环境。

1　材料与方法

1.1材料

细胞共培养孔板，包括若干个相互连接的培养孔、活塞、聚碳酸酯隔膜，活塞采用硅胶或与培养板材质相同材料制作，细胞共培养孔板材质采用国际通用的具有较好光学性能、透明性和生物相容性的聚苯乙烯制作。

1.2方法

本细胞共培养孔板包括若干个相互连接的培养孔，相邻的培养孔之间设有通孔，通孔可由活塞密封，活塞上设有手柄方便装卸，使用时根据实验需求，可卸下 1 个或多个活塞，使培养孔之间互通，达到培养液互通，从而各细胞分泌或代谢产物实现相互影响，相互作用；同时通孔处还可安装隔膜进行悬浮细胞相关实验。用于开展多细胞共培养后分泌或代谢产物的变化研究或针对某一特定靶细胞生物学变化的研究。

图1　细胞共培养六孔板模型图

2　结果

图1 为细胞共培养六孔板，通过活塞的开闭或聚碳酸酯膜的作用实现共培养目的，用于研究人淋巴管内皮细胞（HLEC）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的不同微环境对卵巢癌淋巴结高转移细胞（SKOV3-PM4）的影响，为阐明卵巢癌转移发展机制提供理论依据［5-6］。以细胞共培养六孔板为例，A 细胞为 HLEC 细胞，C 细胞为 SKOV3-PM4 细胞，E 细胞为 HUVEC细胞。在实验中，如需要观察 HLEC细胞对 SKOV3-PM4 细胞的影响，可打开 A、C 细胞培养孔的通孔，实现两者的共培养；如需要观察 HUVEC 细胞对 SKOV3-PM4 细胞的影响，可打开 C、E 细胞培养孔的通孔，实现两者的共培养；如需要观察 HLEC 和 HUVEC细胞对 SKOV3-PM4 细胞的共同影响，可打开 A、C 和 C、E 细胞培养孔的通孔，实现三者的共培养。共培养一定时间后，可显微镜下观察 SKOV3-PM4 的形态变化，提取其RNA 和蛋白质进行基因及蛋白水平表达变化的研究，提取其培养基上清与单独培养的癌细胞培养基上清相比，测其分泌蛋白的变化情况；还可加入成纤维细胞等进行共培养。同时可进行多组实验的观察比较，如 A、C、E 培养 HLEC 细胞，B 培养 SKOV3-PM4 细胞，D 培养过表达 SPARC 基因的 SKOV3-PM4 细胞［7］，F 培养卵巢癌细胞 SKOV3 （SKOV3-PM4 细胞的亲本细胞），共培养一定时间后，可做集落形成、划痕实验等测定癌细胞增殖、迁移能力变化，可用于研究基因干预对癌细胞的生物学作用。在共培养环境下，进行药物干预、研发、减毒增效研究，比药物对单一细胞的研究实验更贴近体内环境，提高准确性。同理，通孔处安装隔膜可进行悬浮细胞相关实验。

细胞共培养孔板可进行多细胞在同一培养体系、同一时间培养，并实现对其分泌或代谢产物的功能及作用机制的后续研究，对靶细胞可达到由点及面，有针对性的研究。同时，还可进行体外单药或多药相关作用的研究。

3　讨论

本细胞共培养孔板可根据不同实验的需求，组装为不同类型和规格。可实现多种细胞非接触共培养，有利于细胞与细胞、细胞与培养环境之间进行物质交换，相互影响，相互作用，从而实现模拟体内环境的作用。同时，不会造成不同细胞之间的污染与混杂，易于收获细胞，有助于后续进行相关功能机制的研究，并可用于体外细胞药物研究，具有准确、可控及方便使用等优势。

经市场调查分析显示，本培养孔板属新产品，功能及优势符合科研实验需求，因此有广阔的发展应用前景。但此技术尚不成熟，还存在一些问题，如培养液的流动性等方面，还需进一步的优化探索及实践。

参考文献

［1］ Zhang S. Beyond the perti dish. Nat Biotechnol， 2004， 22（2）：151-152.

［2］ Saltzman WM， Olbricht WL. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov， 2002， 1（3）：177-186.

［3］ Bhandari RN， Riccalton LA， Lewis AL， et al. Liver tissue engineering：a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Eng， 2001， 7（3）：345-357.

［4］ Lincoln DW 2nd， Phillips PG， Bove K. Estrogen-induced Ets-1 promotes capillary formation in an in vitro tumor angiogenesis model. Breast Cancer Res Treat， 2003， 78（2）：167-178.

［5］ Gao T， Li DR， Li L， et al. Effect of vascular endothelial cell on invasiveness capability of human ovarian carcinoma cell with directional highly lymphatic metastasis. J Guangxi Med Univ， 2012，9（1）：19-23. （in Chinese）高婷， 黎丹戎， 李力， 等. 血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结定向转移细胞侵袭能力的影响. 广西医科大学学报， 2012， 9（1）：19-23.

［6］ Zhang XY， Yin FQ， Liu L， et al. Effects of HLEC on the secreted proteins of epithelial ovarian cancer cells prone to metastasize to lymph nodes. Cancer Biol Med， 2013， 10：221-226.

［7］ Xie YH， Zhong YP， Wang Q， et al. The effect of SPARC gene over-expression on biological characteristics of human ovarian carcinoma cells with directional high lymphatic metastasis. Chin J Cell Biol， 2015， 37（3）：343-350. （in Chinese）谢一泓， 钟艳平， 王琪， 等. SPARC基因过表达对卵巢癌淋巴结高转移细胞生物学特性的影响. 中国细胞生物学学报， 2015， 37（3）：343-350.

·协会之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.016

通信作者：谢一泓，Email：xieyihongxyh@sina.com

收稿日期：2015-10-19