贝伐单抗抑制角膜新生血管形成的实验研究

孙凯建，陈琳琳，王雅文

沈阳市第四人民医院眼科，沈阳 110021



*通信作者

贝伐单抗抑制角膜新生血管形成的实验研究

孙凯建*，陈琳琳，王雅文

沈阳市第四人民医院眼科，沈阳 110021

[摘要]目的观察贝伐单抗在抑制角膜新生血管形成中的作用，并探讨其机制。方法将64只新西兰大白兔分为实验组(32只)及对照组(32只)，采用碱烧伤法进行角膜新生血管形成(CNV)造模,实验组给予角膜下注射贝伐单抗，对照组给予生理盐水角膜下注射，观察角膜水肿程度、CNV面积及长度，Western印迹法检测VEGF、IL-8及PIGF在角膜中的表达水平。结果角膜水肿程度：在造模24 h后，实验组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模21 d后，实验组轻于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。造模3、7、14及21 d时，实验组CNV面积、平均长度均明显小于对照组(P<0.05或P<0.01)。Western blot显示，VEGF在角膜中蛋白水平表达，对照组高于实验组(t=11.516，P<0.01)；对照组与实验组PIGF比较差异无统计学意义(t=1.29，P>0.05)；IL-8在对照组中表达高于实验组(t=4.49，P<0.05)。结论贝伐单抗可通过降低角膜中VEGF及IL-8表达有效抑制角膜水肿及新生血管形成。

[关键词]贝伐单抗；角膜新生血管形成；碱烧伤法

0引言

角膜新生血管(Corneal neovascularization,CNV)以角膜内病理性血管生成为特点，对视力可能产生严重影响，也是多种外眼疾病共同的病理转归[1]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)无论在正常机体还是在病理情况下，均是血管生成的重要诱发及刺激因子，有研究认为，VEGF在CNV病理过程中可能也发挥重要作用[2]。贝伐单抗(Bevacizumab，Avastin)是一种抗VEGF药物，其在CNV中应用的研究较少。本研究通过碱烧伤法建立大鼠CNV模型，给予贝伐单抗结膜下注射，并通过Western blot法对角膜VEGF蛋白水平表达进行检测，观察贝伐单抗对VEFG表达的影响及CNV的作用，并探其机制。

1材料与方法

1.1材料健康新西兰大白兔64只，无眼部疾病，由中国医科大学动物实验室提供并饲养，体重(2.01±0.93)kg。贝伐单抗(美国基因技术研究公司)，VEGF多克隆抗体、IL-8单克隆抗体、PIGF多克隆抗体、辣根过氧化物酶，BCA蛋白定量试剂盒，均购自北京中杉金桥生物制品有限公司。动物喂养及实验过程均符合国家科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》，无伦理学争议。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立、干预及标本采集64只兔随机分为对照组及实验组，每组32只，均取右眼进行实验。CNV模型兔制备方法参照文献方法[3]。模型对照组及贝伐单抗组32只兔采用质量分数为1%的丁卡因滴眼液进行表面麻醉，对眼前段表面进行充分显露，径5.0 mm的单层圆形滤纸片以1 mol/L NaOH溶液浸湿至饱和状态，滤纸片置于大鼠角膜中央，灼烧40 s，生理盐水冲洗结膜囊1 min。依据Meeh-Rubner方法计算剂量，造模后实验组立即给予贝伐单抗0.1 mg球结膜下注射，对照组给予生理盐水0.1 mg球结膜下注射，所有实验兔每日给予妥布霉素滴眼液点眼3次，预防感染。裂隙灯每日观察CNV生长情况，于造模后3、7、14、21 d测量计算CNV生长面积(A)，计算公式：A=C/12×3.141 6[r2-(r-l)2]，C是新生血管累及角膜圆周钟点数，l是新生血管自角膜缘长入角膜最长一直血管长度，r是角膜的半径。于造模后21 d处死所有动物，取兔角膜，行Western blot。采用Dickey标准进行角膜水肿分级。所有动物无实验中脱落。

1.2.2Western blot法检测兔角膜组织中VEGF、IL-8及PIGF蛋白水平的表达按说明书操作步骤提取角膜组织总蛋白，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，样品定量为6 g/L，每条泳道上样蛋白量为50 μg，经12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压70 V，电泳80 min，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入Ⅱ抗室温孵育1.5 h，TBST清洗，ECL发光后以凝胶显像仪显像。

2结果

2.1角膜水肿程度造模24 h后，实验组角膜水肿程度与对照组比较差异无统计学意义(P=0.163)，见表1。造模21 d后，实验组多为Ⅰ、Ⅱ级水肿，对照组多为Ⅱ、Ⅲ级水肿，实验组与对照组比较差异有统计学意义(P=0.027)，见表2。

2.2CNV面积及长度造模24 h后，模型对照组角膜缘血管网扩张充血，3 d时角膜出现侵入血管，血管网状密集，直径较为粗大，长度较长，NV侵入部分烧伤区，8～10 d开始血管生长速度明显增快，进入高峰。12～16 d NV生长减速，回缩。造模24 h后，实验组角膜血管网出现扩张充血，但较模型对照组轻微，3 d时角膜出现CNV，血管网密度较低，血管直径较细。在造模3、7、14及21 d时，实验组CNV面积均明显小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表3；在造模3、7、14及21 d时，实验组CNV平均长度均明显短于对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表4。

表1　造模24 h后两组角膜水肿程度

表2　造模21 d后角膜水肿程度

表3　不同时间CNV面积

表4　不同时间CNV平均长度

2.3Western blot法检测VEGF、IL-8、PIGF的表达Western blot结果显示，在42 kDa处有灰色条带显示，为VEGF在角膜中蛋白水平表达，对照组中表达高于实验组，差异有统计学意义(t=11.516，P<0.01)；18 kDa处有灰色条带显示，为PIGF在角膜组织中表达，对照组与实验组比较差异无统计学意义(t=1.29，P>0.05)；在8 kDa处有灰色条带显示，为IL-8在角膜中蛋白水平表达，对照组中表达高于实验组，差异有统计学意义(t=4.49，P<0.05)，见图1。

图1　Western blot检测VEGF、PIGF及IL-8在角膜中蛋白水平表达

3讨论

角膜新生血管是导致视力减退及失明的严重眼病之一，其中视力减退的发生率约为1/10[4]。VEGF是导致角膜新生血管的重要启动及驱动因子，VEGF无论在肿瘤新生血管还是组织病理或生理新生血管形成中均发挥着重要作用，VEGF、PIGF及IL-8均为重要的促血管生成因子[5]。IL-8及其下游信号通路可促进血管内皮细胞的血管生成反应。针对血管生成中靶因子的药物是抑制新生血管形成的重要治疗手段。

贝伐单抗是VEGF抑制剂，是人源化单克隆抗体，目前作为抑制肿瘤血管生成的药物在多种肿瘤中得到应用[6-7]。目前，角膜新生血管的治疗无论是局部滴用糖皮质激素或非甾体类抗炎药，或对新生血管进行激光、电凝、光凝及光动力等物理疗法，均不能得到良好的效果，而且，在这些理化因素的刺激下，CNV可能会进一步加重[8-9]。贝伐单抗在CNV中应用的研究目前较少。贝伐单抗可与VEGF结合，并抑制其与内皮细胞表面受体的结合，从而抑制新生血管的形成、生长及蔓延成网[10]。

本研究建立了兔CNV模型，并采用角膜下注射贝伐单抗的方式观察其在CNV病理过程中所发挥的作用，结果显示，角膜水肿程度造模24 h后，实验组与对照组之间无差别，但在造模21 d后，实验组角膜水肿消退明显，Ⅲ、Ⅳ级水肿多降为Ⅰ、Ⅱ级水肿，而对照组改善没有实验组明显。有研究表明，VEGF、PIGF及IL-8在损伤早期在组织间液或毛细血管网中显著升高，进而出现组织充血水肿等病理反应[11]。本研究显示，贝伐单抗在组织损伤早期并不能减轻水肿反应，说明VEGF等炎性因子的激发过程不能被阻断在组织损伤早期，而且早期VEGF在充血水肿过程中并不是主导因子，但在中后期炎症因子水平下降后，VEGF的产生被贝伐单抗抑制，从而使组织水肿程度下降。造模后实验组角膜血管网扩张充血程度明显低于对照组，实验组CNV血管网密度较低，血管直径较细，CNV平均长度明显短于对照组。说明在贝伐单抗作用下，CNV在口径、数量及长度等方面均明显受到抑制。Western blot显示，对照组VEGF及IL-8在角膜中蛋白水平表达高于实验组，PIGF在对照组与实验组间差异无统计学意义。已经有多项实验证明，贝伐单抗对VEGF有抑制作用[12]，但对IL-8抑制作用的研究较少。本研究显示，贝伐单抗在抑制VEGF的同时，对IL-8也具有抑制作用，但该作用是VEGF下游通路导致IL-8受到抑制，还是有其他信号通路直接参与，需要进一步实验证明。

本研究通过兔CNV模型观察了贝伐单抗对CNV的抑制作用，实验表明，贝伐单抗对CNV血管形成具有明显的抑制作用，通过抑制VEGF及IL-8蛋白表达水平实现。

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Inhibition effect of bevacizumab on corneal neovascularization

SUN Kai-jian*,CHEN Lin-lin,WANG Ya-wen

(Department of Ophthalmology,the Fourth People′s Hospital of Shenyang,Shenyang 110021,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the inhibiting effect of bevacizumab on corneal neovascularization and discuss the mechanism.MethodsA total of 64 New Zealand white rabbits were divided into experimental group (n=32) and control group (n=32),and CNV (corneal neovascularization) model was made by alkaline burning method.Bevacizumab or normal saline was given by subconjunctival injection in experimental group and control group respectively,and then corneal edema degree,CNV area and length were observed.VEGF,IL-8 and PIGF expressed at protein level in cornea were detected by Western blot assay.ResultsNo significant difference was found in the corneal edema degree between experimental group and control group after 24 h(P>0.05).The corneal edema degree in experimental group was milder than that in control group after 21 d(P<0.05)；CNV area and length after 3,7,14 and 21 d in experimental group were smaller than those in control group(P<0.05 or P<0.01).Western blot showed VEGF in control group was higher than those in experimental group(t=11.516，P<0.01)；PIGF expression was the same in the two groups(t =1.29，P>0.05);IL-8 in control group was higher than that in experimental group(t=4.49，P<0.05) ConclusionBevacizumab may inhibit the corneal edema and CNV by decreasing the expression of VEGF and IL-8.

Key words：Bevacizumab;Corneal neovascularization；Alkaline burning method

收稿日期：2015-07-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604007