槲皮素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

李冬梅，张元媛，徐　丽，曹军平

武警总医院a.药剂科，b.消毒供应科，北京 100039



*通信作者

槲皮素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

李冬梅a，张元媛a，徐丽a，曹军平b*

武警总医院a.药剂科，b.消毒供应科，北京 100039

[摘要]目的探讨槲皮素(QU)对心肌缺血再灌注(MI/R)损伤的保护作用及其作用机制。方法采用结扎左冠脉前降支30 min再灌注2 h的方法复制MI/R损伤大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、QU组(25、50、100 mg/kg)，每组10只，各组于术前1周开始灌胃给药，1次/d。再灌注后取心脏，染色法测定心肌梗死面积；免疫组化法测定心肌组织NF-κB和ICAM-1表达情况；取心肌匀浆，髓过氧化物酶(MPO)法测定中性粒细胞浸润情况。结果QU高、中剂量可分别缩小心肌梗死面积至25.00%、25.31%，与模型组(32.55%)比较差异有统计学意义(P<0.05)；QU各剂量组心肌MPO活力分别降低至185.70、190.66、210.03 U/g，与模型组(311.72 U/g)比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；QU各剂量组心肌组织ICAM-1阳性区面积百分比分别降至32.08%、32.65%、36.42%，与模型组(42.67%)比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；QU高、中剂量可使心肌NF-κB的表达水平分别降低至55.23%、54.90%，与模型组(61.05%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论QU预处理可保护MI/R所致心肌损伤，其机制与抑制中性粒细胞浸润、下调NF-κB和ICAM-1的表达等有关。

[关键词]槲皮素；心肌缺血再灌注损伤；中性粒细胞；细胞间黏附分子-1；核因子-κB

0引言

槲皮素(Quercetin，QU)属于黄酮类化合物，广泛存在于植物的花、叶和果实中，具有多种生物学活性和重要的药用价值，其已知药理作用包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫抑制和心血管保护等[1]，最近研究发现其还具有抗衰老、降血糖、抗抑郁等作用[2]，在医药、保健等方面具有广阔的应用前景。近年研究证实，QU在体内外对心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤的心肌组织具有保护效应[3-4]，然而其机制尚不清楚。本研究应用MI/R损伤大鼠模型，拟探讨QU心肌保护作用机制，为临床用药提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2药品和试剂QU(纯度≥95%)购自Sigma公司，用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成所需浓度。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。核因子-κB(NF-κB)p65多克隆一抗、过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)多克隆抗体试剂盒、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法免疫组织化学试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1建立MI/R损伤模型采用冠脉结扎法建立MI/R损伤模型，参照文献[5]加以改进。取大鼠，术前12 h禁食不禁水，戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，四肢连接ECG-1350P型十二导联心电图机。颈部分离气管，插入气管插管，连接DW-3000型动物人工呼吸机(呼吸频率60次/min，潮气量2 mL/100 g)。顺肋间隙方向于胸骨左旁第3、4肋间开胸，分别在第3、4肋上环绕1根0号手术线，牵拉手术线使肋骨撑开，暴露心脏，沿左心耳下缘冠脉前降支起始部3～4 mm处用4-0带线缝合针穿过，进针深度控制在0.1 cm左右，将一小段直径1.5 mm的乳胶管置于结扎线下，收紧结扎线以造成心肌缺血，约30 min后(冠脉结扎成功的标志：心电图ST段明显抬高或T波高耸)，松开结扎线再灌注2 h(再灌注成功的标志：抬高的ST段下降1/2以上或高耸的T波下降)。结扎前心电图不正常者，未到观察终点而死亡者及造模不成功者剔除。

1.3.2分组和给药将成模大鼠随机分为QU低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg)及模型组，每组10只。另取10只大鼠，开胸但不结扎冠脉，作为假手术组。各组于术前1周开始灌胃给药，1次/d，假手术组和模型组给予等体积0.5% CMC-Na。

1.3.3心肌梗死面积的测定取心脏，用PBS缓冲液洗后，去除心房、血管及脂肪组织，在冠脉结扎线下，从心尖起将心室平行切成厚度相等的5片，放入0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色，正常心肌则呈蓝色，图像采集后，通过软件ImagePro Plus 7.0测算梗死区面积和心室总面积，计算心肌梗死面积(%)[6]。

1.3.4心肌髓过氧化物酶(MPO)活力的测定取部分心脏，生理盐水洗后，上自动匀浆机制成匀浆，3 500 r/min离心10 min得上清，采用比色法分光光度计460 nm下测定OD值，并计算MPO活力，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.3.5心肌组织NF-κB和ICAM-1表达的测定取心脏，生理盐水洗后，在冠脉结扎线下取心肌行冰冻切片，厚度8 μm，采用免疫组化法检测NF-κB和ICAM-1的表达情况，具体步骤按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。图像采集后，通过软件ImagePro Plus 7.0分析图像，其阳性追踪点为表达于胞浆或胞核的棕黄色颗粒状物，测量阳性染色区面积，结果用阳性区面积百分比(阳性染色区面积/视野面积)表示。

2结果

2.1QU对心肌梗死面积的影响假手术组不纳入统计学比较；模型组大鼠心肌梗死面积达32.55%，QU高、中剂量组可分别使心肌梗死面积缩小至25.00%、25.31%，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1　各组心肌梗死面积比较(n=10)

2.2QU对中性粒细胞浸润的影响缺血30 min再灌注2 h后，模型组大鼠心肌MPO活力显著升高至311.72 U/g，与假手术组(27.60 U/g)比较差异有统计学意义(P<0.01)；QU各剂量组心肌MPO活力分别降低至185.70、190.66、210.03 U/g，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，提示QU可减轻中性粒细胞浸润。见图2。

图2　各组心肌MPO活力比较(n=10)

2.3QU对心肌ICAM-1和NF-κB表达的影响缺血30 min再灌注2 h后，模型组大鼠心肌组织ICAM-1、NF-κB的表达水平分别升高至42.67%、61.05%，与假手术组(分别为11.73%、6.29%)比较差异均有统计学意义(P<0.01)；QU各剂量组心肌组织ICAM-1阳性区百分比分别降低至32.08%、32.65%、36.42%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；QU高、中剂量可使心肌组织NF-κB的表达水平分别降至55.23%、54.90%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3　各组心肌ICAM-1和NF-κB表达比较(n=10)

3讨论

药物预处理可保护MI/R损伤的心肌组织，研究发现，此作用主要通过促使机体释放生物活性物质或直接激活保护机制，增强心脏对缺血、缺氧的耐受而实现的[7]。本研究采用缺血前给药的方式观察QU预处理对MI/R损伤的保护作用，结果显示，QU(50、100 mg/kg)能显著缩小心肌梗死面积，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示QU对MI/R损伤大鼠具有一定的心肌保护作用。

MI/R损伤是一个包括中性粒细胞活化、多种细胞因子及黏附分子过度表达、伴有多种炎性介质及信号传导分子参与的复杂过程，研究表明，以中性粒细胞浸润为主的炎症是造成MI/R损伤的重要因素之一[8]，更有学者认为MI/R损伤是“中性粒细胞依赖”[9]。MI/R发生时激活的中性粒细胞聚集到心肌组织，通过一系列病理机制造成心肌细胞的损伤和功能的丧失，如：释放炎性介质、细胞毒性产物，直接损伤心肌；黏附于微循环，阻塞毛细血管，造成“无复流现象”；释放氧自由基，增强脂质过氧化反应，导致内皮细胞功能障碍等[10]。通过对大鼠MI/R心肌组织的中性粒细胞进行定量分析，发现其含量较正常心肌组织显著升高，且在再灌注2 h时达到峰值[11]。研究证实，抑制中性粒细胞浸润能显著降低MI/R损伤的程度，抗中性粒细胞治疗有可能成为防治MI/R的有效措施[8,12]。MPO酶为中性粒细胞所特有，通过分析该酶的活力，可判断中性粒细胞浸润的程度。本研究结果表明，缺血再灌注后MPO活性显著升高，提示中性粒细胞浸润明显；QU预处理可使心肌MPO活性明显下降(P<0.05，P<0.01)，提示QU可通过抑制心肌内中性粒细胞浸润、减轻炎症反应来保护受损的心肌组织。

黏附分子ICAM-1(CD54)属免疫球蛋白超家族成员，存在于白细胞、内皮细胞和心肌细胞等细胞表面[13]。ICAM-1在MI/R损伤的病理机制中发挥重要作用，是介导中性粒细胞浸润的最重要因素之一。有研究表明，生理条件下，心肌细胞仅表达极少量的ICAM-1，但当MI/R发生时，在多种炎性介质及细胞因子的作用下，心肌细胞ICAM-1表达量会成倍增加[14]。ICAM-1在心肌细胞的高表达可刺激中性粒细胞与血管内皮细胞黏附，介导中性粒细胞对心肌组织的浸润，最终导致心肌细胞受损、死亡[15]。崔世涛等[16]研究发现，应用ICAM-1单抗可抑制中性粒细胞与血管内皮细胞之间的黏附，减少中性粒细胞在心肌内积聚，改善心肌灌注，减少心肌损伤。唐旭东等[17]在MI/R损伤家兔模型的研究中发现，ICAM-1的表达在再灌注120 min开始增高，并与中性粒细胞浸润数升高有相关性。Benson等[18]认为，ICAM-1有可能会成为防治心肌缺血疾病的一个理想靶点。

本研究结果表明，冠脉结扎30 min再灌注2 h后，心肌组织ICAM-1表达明显升高，与上述文献报道结论一致；QU各剂量可使心肌组织ICAM-1的表达阳性区百分比显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，提示QU通过抑制ICAM-1表达，减少中性粒细胞等炎性细胞向心肌细胞浸润，从而减轻心肌组织损伤。

NF-κB广泛存在于各种类型细胞(包括心肌细胞、血管内皮细胞)中，作为一种具有基因转录多向调控作用的转录因子，可调控多种炎症相关蛋白基因的表达[19]。生理条件下，NF-κB以非活性状态存在于胞浆中，当MI/R发生时，NF-κB得以活化，进入细胞核，调控一系列靶基因的表达，如ICAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6等。这些炎症介质可促使中性粒细胞在心肌缺血区血管中黏附、聚集，并浸润心肌组织，造成血管及心肌损伤；上述炎症介质又会进一步激活NF-κB，形成恶性循环[20]。杨锐等[21]观察了大鼠心肌缺血的不同再灌注时程NF-κB p65蛋白表达的变化，结果显示，NF-κB p65蛋白表达量于再灌注60 min时达高峰，再灌注120 min时依然维持在高水平。Li等[22]研究表明，抑制NF-κB活性后，MI/R大鼠心肌损伤的程度明显减轻。由此可见，NF-κB被激活启动多种炎症介质的表达是MI/R损伤的重要机制之一。本研究观察显示，冠脉结扎30 min再灌注2 h后，心肌组织NF-κB p65蛋白表达显著增加，与模型组比较，QU高、中剂量(50、100 mg/kg)可使心肌组织NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)，提示QU通过抑制NF-κB活性，抑制其下游调控基因的表达，这可能是QU心肌保护作用机制的一个方面。

综上，QU预处理可下调黏附分子ICAM-1表达，减少中性粒细胞浸润，抑制转录因子NF-κB活性，缓解缺血再灌注过程中的炎症反应，进而实现对MI/R损伤心肌的保护作用。

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Study of protective effect and the mechanisms of quercetin on myocardial ischemia/reperfusion injury

LI Dong-meia,ZHANG Yuan-yuana,XU Lia,CAO Jun-pinb*

(a.Department of Pharmacy,b.Department of Sterilization and Supply,General Hospital of Armed Police Forces,Beijing 100039,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect and the mechanisms of quercetin (QU) on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury.MethodsRat model of MI/R injury was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.The rats were divided randomly into 5 groups (n=10): sham group,model group,QU groups (25,50,100 mg/kg).QU was orally administered once daily since 7 d before operation.The area of myocardial infarction was recorded after reperfusion.The myocardial ICAM-1 and NF-κB activities were detected by immunohistochemistry.The MPO activity in heart homogenate was detected.ResultsThe area of myocardial infarction in QU (50,100 mg/kg) groups was reduced respectively,there being significant difference between QU (50,100 mg/kg) groups and model group (P<0.05).The MPO activity in QU groups was lower than that of model group (P<0.05,P<0.01).The ICAM-1 positive rates of heart in QU groups decreased (P<0.05,P<0.01).The NF-κB positive rates in QU (50,100 mg/kg) groups decreased,and there were significant differences between QU (50,100 mg/kg) groups and model group (P<0.05).ConclusionQU pretreatment can protect against MI/R injury by the inhibition of neutrophil infiltration and down-regulation of ICAM-1 and NF-κB expression.

Key words：Quercetin;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Neutrophil;ICAM-1;NF-κB

收稿日期：2015-07-14

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604005