BRAF基因突变型的甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的预测模型

蔡业丰　倪纯珏　陈恩东　郑华敏　张筱骅　李　权▲.温州医科大学附属第一医院肿瘤外科，浙江温州　5000；.温州医科大学附属第一医院麻醉科，浙江温州　5000；.温州医科大学附属第一医院超声影像科，浙江温州　5000



BRAF基因突变型的甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的预测模型

蔡业丰1倪纯珏2陈恩东1郑华敏3张筱骅1李权1▲
1.温州医科大学附属第一医院肿瘤外科，浙江温州325000；2.温州医科大学附属第一医院麻醉科，浙江温州325000；3.温州医科大学附属第一医院超声影像科，浙江温州325000

[摘要]目的在BRAF基因突变型的甲状腺乳头状癌中，构建预测中央区淋巴结转移的预测模型。方法回顾性分析179例BRAF基因突变型的PTC。根据临床病理资料，通过单因素、多因素统计学分析中央区淋巴结转移的独立预测因子，使用标准化回归系数,根据独立预测因子来构建“10分制”的预测模型，ROC曲线来评估预测模型的预测价值。结果男性（P＜0.001），年龄＜45岁（P=0.042），肿瘤大小≤9 mm（P=0.002），下极（P=0.045），B超示淋巴结转移（P=0.012）是BRAF突变型的PTC中央区淋巴结转移的独立预测因子。对评分模型进行验证，确定3.25分为预测模型的最佳截值点，其预测的灵敏度为73.5%，特异度为67.9%。结论在BRAF基因突变型的PTC中，本研究的中央区淋巴结转移的预测模型具有一定预测价值，对指导PTC的手术具有重要的临床意义。当结节的评分＞3.25分时，可以考虑予以中央区淋巴结清扫，而当评分＜3.25分时，可以考虑不予以中央区淋巴结清扫。

[关键词]甲状腺乳头状癌；中央区淋巴结转移；预测模型；BRAF；淋巴结清扫

▲通讯作者

甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，约占人类所有恶性肿瘤的1%～2%[1-4]，临床上最常见的病理类型是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），占所有甲状腺恶性肿瘤的85%～90%[5]。PTC的预后较好，其5年生存率为95%～97%[6，7]，但在早期可出现颈部淋巴结转移，尤其见于中央区淋巴结[8]。目前，对于PTC来说，甲状腺叶切除或全甲切除加中央区淋巴结清扫被认为需要常规执行，但是对于PTC是否行预防性中央区淋巴结清扫仍争议不断。然而这些争议的根本原因是目前缺乏对中央区淋巴结是否存在转移的准确预测方式。2003年，霍普金斯大学医学院Xing M等[5]首次在PTC中报道了BRAF V600E突变，并且发现BRAF基因突变与甲状腺颈部淋巴结转移有着密切的关系[7]。邢明照之后的研究发现，BRAF基因突变与PTC中央区淋巴结转移存在强相关性，建议BRAF基因结合PTC的临床病理特征来预测中央区淋巴结转移情况[8，9]。故本研究旨在BRAF基因突变型的PTC患者中，根据术前不同的超声图像，结合临床病理资料，建立一个中央区淋巴结转移的预测模型，从而实现对BRAF基因突变型的PTC患者中央区淋巴结转移情况的预测，进而指导PTC的手术方式，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

回顾性收集本院2012年1月～2014年12月的最终病理确诊甲状腺乳头状癌的患者共179例，既往无甲状腺手术病史，且接受颈部中央区淋巴结清扫，肿瘤标本经BRAF基因检测证实为BRAF V600E突变。

1.2方法

1.2.1术式选择根据我国2012年《中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌指南》，单侧PTC患者根据均行患侧甲状腺叶+峡部切除及患侧中央区淋巴结清扫术，双侧PTC患者行甲状腺全切加双侧中央区淋巴结清扫术，中央区淋巴结清扫范围：上界至甲状软骨，下界达主动脉弓上缘水平，外侧界为颈动脉鞘内侧缘，包括气管前、气管旁、喉前淋巴结等。

1.2.2患者资料收集患者术前超声检查由一位经验丰富的超声科医生所做，使用Acuson Sequoia 512型或GE logiq7型彩超诊断仪，探头频率8～13 MHz，严格按照甲状腺超声规范对甲状腺结节的位置、包膜情况、钙化、纵横比等相关因素进行详细描述。术后病理由我院2位经验丰富的病理科医生共同完成，报告结果包括：病理类型，肿块大小，桥本甲状腺炎以及中央区淋巴结转移情况等。

1.2.3DNA提取及BRAF突变基因检测取患者新鲜肿瘤组织，由Qiagen 51306 QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取DNA，经PCR扩增后，琼脂糖电泳，确定单一条带后，送上海invitrogen公司进行sanger测序。

1.2.4测序后分析测序后使用Chromas 2.4.1软件分析，突变点的波峰大于30%定义为BRAF V600E突变。

1.3统计学处理

采用SPSS13.0统计学软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov检验来判断其是否符合正态分布，如果符合正态分布，则组间比较根据数据类型分别采用独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用非参数Mann-Whitney检验。计数资料以频数及率表示，组间比较根据数据类型采用χ2检验。采用单因素和多因素Logistic回归分析评价相关因素对中央区淋巴结转移的影响，并且使用标准化回归系数对多因素结果进行权重分析，然后构建“10分制”的预测模型。通过ROC曲线，确定最佳的截点值，并且计算其预测中央区淋巴结转移的敏感性和特异性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1单因素与多因素分析

179例患者中发生中央区淋巴结转移98例（54.7%），以中央区淋巴结是否转移分为转移组和未转移组，单因素分析结果显示：性别、年龄、肿瘤位置，单/多灶性、肿瘤大小、桥本、B超示淋巴结转移和甲状腺腺内播散与中央区淋巴结转移存在相关性，差异具有统计学意义（P＜0.05），而包膜侵犯、钙化、边界、形状、内部构成、纵横比等与中央区淋巴结转移不存在统计学相关性（P＞0.05）。见表1。多因素Logistics分析结果显示：男性、年龄＜45岁、肿瘤大小≤9 mm、肿瘤位置呈下极、B超示淋巴结转移是中央区淋巴结转移的独立预测因子（P＜0.05）。见表2。

2.2BRAF基因检测

BRAF V600E突变点主要位于BRAF编码区第1799号位点的碱基由T（胸腺嘧啶）突变为A（腺嘌呤）（封三图1）。

2.3中央区淋巴结转移的预测模型

如表2所示，运用标准回归系数对每个多因素分析有意义的独立预测因子进行权重分析，并且根据它们的权重构建“10分制”的中央区淋巴结转移的预测模型。根据预测模型，统计两组各个患者的分值。转移组的中位分值及其四分位数为2.0（1.5～3.5）分，未转移组为4.5（2.6～6.0）分，两组比较差异有高度统计学意义（Z= -6.242，P＜0.01）。在ROC曲线分析中，ROC曲线下面积为0.769（封三图2）。当预测模型的预测分值为3.25分时，＞3.25分组其中央区淋巴结转移率为73.4%（72/98），＜3.25分组其中央区淋巴结转移率为32.1%（26/81），其判断BRAF基因突变型患者的中央区淋巴结转移的预测能力最佳，其灵敏度和特异性分别为73.5%和67.9%。

表1　甲状腺乳头状癌超声及临床病理特征与中央区淋巴结转移的关系[n（%）]

表2　多因素Logistic回归分析

3　讨论

PTC是甲状腺癌中最常见的类型，预后较好，颈部淋巴结转移是影响PTC复发和死亡最重要的因素，也是决定PTC手术的重要因素。目前研究认为，甲状腺中央区淋巴结是PTC发生淋巴结转移的第一站且是最常累计的淋巴结[10]。并且目前研究也已证实PTC伴有区域淋巴结转移与局部复发和肿瘤相关死亡率有关[5，11]。NCCN甲状腺癌诊疗指南对于PTC是否行中央区淋巴结清扫有以下说明：对于术前或术中提示有淋巴结肿大或转移征象，以及淋巴结穿刺提示转移的，予以治疗性的中央淋巴结清扫，对于临床上未发现淋巴结肿大或转移的征象，可以考虑予以预防性中央区淋巴结清扫[12]。因此，我国在《中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌指南》中推荐PTC行腺叶或全甲切除同时，予以行同侧预防性颈部中央区淋巴结清扫。但是，随着大型临床研究的开展，越来越多的研究发现预防性中央区淋巴结清扫并没有降低局部复发，也未增加生存率，反而会增加手术并发症，如甲状腺旁腺功能低下，喉返神经损伤，喉上神经损伤等[13，14]。

BRAF V600E突变是一种体细胞突变，突变引起BRAF蛋白第600位密码子的缬氨酸转变为谷氨酸，从而导致BRAF激酶和Ras-Raf-MEK-MAP激酶/ ERK通路(MAPK通路)的持续活化，造成细胞异常增殖，进而导致肿瘤生成[15]。目前发现，BRAF V600E突变是PTC中最重要的基因突变，其突变率可高达73.4%[16，17]。BRAF基因突变是PTC发生中央区淋巴结转移的独立影响因素，并且该因素参与激活的MAPK通路起到了非常重要的作用。目前越来越多的学者建议甲状腺结节术前穿刺或术后冰冻检测BRAF基因突变情况，更有许多学者建议BRAF基因突变的患者应当予以更加积极的治疗，尤其是颈部淋巴结的清扫。但是BRAF基因突变的患者，其颈部淋巴结转移率为16%～78%，平均为44%左右[15]，本研究BRAF基因突变型的PTC其中央区淋巴结转移发生率为54.7%。因此单纯使用BRAF基因检测指导中央区淋巴结清扫还存在一定的不足。

超声图像在甲状腺癌诊断中起到至关重要的作用，临床病理资料又是甲状腺癌诊疗中的重要依据。因此我们以超声图像为主，结合临床病理资料，通过多因素分析，确定影响BRAF基因突变型的PTC患者发生中央区淋巴结转移的独立预测因子，通过标准化回归系数等方法构建其的预测模型。多项研究已发现男性PTC患者更容易发生中央区淋巴结转移[18-22]。Ahn等[23]发现年龄和肿瘤大小是中央区淋巴结转移的一个独立影响因子。Wang等[24]发现肿瘤位于中极和下极更容易发生中央区淋巴结转移。Ito等[25]发现B超提示有转移征象的淋巴结，更容易发生局部淋巴结复发。在我们的统计分析结果显示：性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、B超示淋巴结转移是中央区淋巴结转移的独立预测因子，该结果符合先前的研究结果。本研究通过标准化回归系数对多因素结果进行权重分析，对每一个影响因素予以不同的评分，从而建立一个对BRAF基因突变型的PTC的中央区淋巴结转移的预测模型。并对每一个PTC患者计算预测评分，发现预测评分在中央区淋巴结转移组和未转移组之间有统计学意义，再通过绘制ROC曲线，确定截值点为3.25分，＞3.25分组其中央区淋巴结转移率为73.4% （72/98），＜3.25分组其中央区淋巴结转移率为32.1% （26/81），预测BRAF基因突变型的PTC发生中央区淋巴结转移的灵敏度为73.5%，特异性为67.9%。因此，以3.25分为截点时，结节的预测分数＞3.25分时，其发生中央区淋巴结转移的风险较大，建议行中央区淋巴结清扫；当预测分数＜3.25时，其发生中央区淋巴结转移的风险较小，可以考虑不予以中央区淋巴结清扫。

结合BRAF基因和超声、临床病理特征，本研究首次在BRAF基因突变型的甲状腺乳头状癌中构建中央区淋巴结转移的预测模型，确定3.25分为截值点，当预测分数＞3.25分时，其发生中央区淋巴结转移的风险较大，建议行中央区淋巴结清扫；当预测分数＜3.25时，其发生中央区淋巴结转移的风险较小，可以考虑不予以中央区淋巴结清扫。该预测模型可以为外科医生行PTC手术时是否行中央区淋巴结清扫提供一个简便、直观的量化指标，避免不必要的中央区淋巴结清扫。

[参考文献]

[1] Siegel R，Ma J，Zou Z，et al. Cancer statistics，2014[J]. CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9-29.

[2] Nix P，Nicolaides A，Coatesworth AP，Thyroid cancer review 1：presentation and investigation of thyroid cancer[J]. Int J Clin Pract，2005，59（11）：1340-1344.

[3] Yassa L，Cibas ES，Benson CB，et al. Long-term assessment of a multidisciplinary approach to thyroid nodule diagnostic evaluation[J]. Cancer，2007，111（6）：508-516.

[4] Paes JE，Hua K，Nagy R，et al. The relationship between body mass index and thyroid cancer pathology features and outcomes：a clinicopathological cohort study[J]. J Clin Endocrinol Metab，2010，95（9）：4244-4250.

[5] Xing M，Alzahrani AS，Carson KA，et al. Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer[J]. JAMA，2013，309（14）：1493-1501.

[6] Davies L，Welch HG. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States 1973-2002[J]. JAMA，2006，295（18）：2164-2167.

[7] Cohen Y，Xing M，Mambo E，et al. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma[J]. J Natl Cancer Inst，2003，95（8）：625-627.

[8] Alzahrani AS，Xing M. Impact of lymph node metastases identified on central neck dissection（CND) on the recurrence of papillary thyroid cancer：Potential role of BRAFV 600E mutation in defining CND[J]. Endocr Relat Cancer，2013，20（1）：13-22.

[9] Li F，Chen G，Sheng C，et al. BRAFV600E mutation in papillary thyroid microcarcinoma：a meta-analysis[J]. Endocr Relat Cancer，2015，22（2）：159-168.

[10] Noguchi S，Noguchi A，Murakami N. Papillary carcinoma of the thyroid I. developing pattern of metastasis[J]. Cancer，1970，26（5）：1053-1060.

[11] Xing M，Alzahrani AS，Carson KA，et al. Association between BRAF V600E mutation and recurrence of papillary thyroid cancer [J]. J Clin Oncol，2015，33（1）：42-50.

[12] Tuttle RM，Haddad RI，Ball DW，et al. Thyroid carcinoma，version 2.2014[J]. J Natl Compr Canc Netw，2014，12 （12）：1671-1680.

[13] Zetoune T，Keutgen X，Buitrago D，et al. Prophylactic central neck dissection and local recurrence in papillary thyroid cancer：A meta-analysis[J]. Ann Surg Oncol，2010，17（12）：3287-3293.

[14] Carling T，Long WD. Udelsman，controversy surrounding the role for routine central lymph node dissection for differentiated thyroid cancer[J]. Curr Opin Oncol，2010，22 （1）：30-34.

[15] Xing M. BRAF mutation in papillary thyroid cancer：Pathogenic role，molecular bases，and clinical implications[J]. Endocr Rev，2007，28（7）：742-762.

[16] Namba H，Nakashima M，Hayashi T，et al. Clinical implication of hot spot BRAF mutation，V599E，in papillary thyroid cancers[J]. J Clin Endocrinol Metab，2003，88（9）：4393-4397.

[17] Xing M. Prognostic utility of BRAF mutation in papillary thyroidcancer[J].Mol Cell Endocrinol，2010，321（1）：86-93.

[18] Liang KL，He W，Dong，et al. Risk factors of central lymph node metastasis in cN0 papillary thyroid carcinoma：a study of 529 patients[J]. Med Sci Monit，2014，20：807-811.

[19] Salter KD，Andersen PE，Cohen JI，et al. Central nodal metastases in papillary thyroid carcinoma based on tumor histologic type and focality[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2010，136（7）：692-696.

[20] Koo BS，Choi EC，Park YH，et al. Occult contralateral central lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma with unilateral lymph node metastasis in the lateral neck[J]. J Am Coll Surg，2010，210（6）：895-900.

[21] Roh JL，Kim JM，Park CI，Central lymph node metastasis of unilateral papillary thyroid carcinoma：Pat terns and factors predictive of nodal metastasis，morbidity，and recurrence[J]. Ann Surg Oncol，2011，18（8）：2245-2250.

[22] Miao S，Mao X，Pei R，et al. Predictive factors for different subgroups of central lymph node metastasis in unilateral papillary thyroid carcinoma[J]. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2013，75（5）：265-273.

[23] Ahn BH，Kim JR，Jeong HC，et al. Predictive factors of central lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J]. Ann Surg Treat Res，2015，88（2）：63-68.

[24] Wang W，Gu J，Shang J，et al. Correlation analysis on central lymph node metastasis in 276 patients with cN0 papillary thyroid carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol，2013，6（3）：510-515.

[25] Ito Y，Miyauchi A. A therapeutic strategy for incidentally detectedpapillarymicrocarcinomaofthethyroid[J].Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2007，3（3）：240-248.

A predictive model for the central lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma with BRAF gene mutation

CAI Yefeng1NI Chunjue2CHEN Endong1ZHENG Huamin3ZHANG Xiaohua1LI Quan1
1.Department of Oncological Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China; 3.Department of Ultrasound, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

[Abstract]Objective To establish a predictive model for the central lymph node metastasis (CLNM) in papillary thyroid carcinoma (PTC) with BRAF gene mutation. Methods Retrospectively analyzed of 179 patients of papillary thyroid carcinoma with BRAF gene mutation were enrolled. Univariate and multivariate analyses were performed to find the independent predictors for CLNM based on clinicopathological and US features. Used the standardized regression coefficient, a 10-point score system was constructed in line with the independent predictors. Then, ROC curves determined the cutoff value and evaluated its predictive value in predicting CLNM. Results Man (P＜0.001), age＜45 years (P=0.042), tumor size≤9 mm (P=0.002), the lower pole (P=0.045), display of metastasis lymph node (P=0.012) were the independent predictors for CLNM in PTC with BRAF gene mutation. Verifying the scoring system, a cutoff value of 3.25 point was found to be best prediction for CLNM and its sensitivity and specificity were 73.5% and 67.9%. Conclusion The predictive model is helpful for surgeons to decide the most suitable surgical strategy for PTC with BRAF gene mutation. When the score＞3.25, the central lymph node dissection should be considered. While the score＜3.25, the central lymph node dissection (CLND) ought to be cautious.

[Key words]Papillary thyroid carcinoma; Central lymph node metastasis; Predictive model; BRAF; Lymph node dissection

[中图分类号]R736.1

[文献标识码]A

[文章编号]1673-9701（2016）03-0001-04

[基金项目]国家863高技术研究发展计划（2012AA02A210）；浙江省温州市科技计划项目（Y20140136）

收稿日期：（2015-08-12）