石蜡切片技术在本科教学中的应用

王树芸 韩秀兰 霍学慧 毕建杰 王启柏 李圣福 郭风法

【摘要】石蜡切片技术是一门非常实用的实验技术，但由于其制作步骤繁琐、耗时长，很难应用到本科教学中。经本实验改良的石蜡切片钌红染色法具有简单、易操作、染色效果好，学生容易掌握的特点，所需课时量仅13课时。将石蜡切片技术与高校实验课程相结合，利于该技术在本科教学中广泛推广。

【关键词】石蜡切片 钌红染色法 本科教学

【基金项目】1.山东农业大学教研项目“数字化植物教学标本园建设”；2.山东农业大学教研项目“农科类数字化实验教学中心建设”。

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2016）05-0172-02

石蜡切片是进行组织学、生物学研究的常用实验方法。石蜡切片包括标本采集固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、展片、烤片、烘片、脱蜡、染色、封片等一系列步骤制成透明的薄片，通过光学显微镜观察，可以观察植物组织的细胞结构和状态。但因其制作步骤繁琐，耗时长，一般不列为本科教学的实验内容。而石蜡切片技术应用范围广、实用性强，所以本实验通过改良、简化其步骤，使这门技术可以更好的应用到本科实验教学中。

目前，各大高等院校对大学生动手实践能力的培养，已成为教育改革的重要内容。实验教学是培养学生实践能力的重要手段，是理论课替代不了的。所以，将石蜡切片技术应用到本科实验教学中，对教育改革可以起到推动作用。

一、材料与方法

1.实验材料

山东农业大学南校区校园中的樱花树叶或者杨树叶。

2.实验试剂和器材

无水乙醇、二甲苯、冰醋酸均为天津凯通生产

石蜡为SIGMA中国有限公司生产的蜡片，熔点52℃-56℃

中性树胶为上海生工生产

卡诺固定液：无水乙醇：冰醋酸=3：1，于青霉素小瓶贮存，现用现配。

明胶（粘片剂）：1g明胶溶于100ml蒸馏水放在36℃烘箱，全部溶解后，再加15ml甘油，2g石炭酸，完全溶解后，分成小瓶，储存在细口瓶中备用。

钌红染色液：0.04g钌红固体染料溶解于200ml蒸馏水中，现用现配。

15ml注射器，用于快速抽气。

以上所述溶剂都由实验老师提前配制准备好。

3.实验仪器

半自动石蜡切片机为浙江省金华市科迪仪器设备有限公司生产，型号是YZB。

电热恒温鼓风干燥箱为上海新苗医疗器械制造有限公司，型号是DHG-91435-11。

4.实验步骤

步骤1.取材固定

将新鲜材料剪成0.5cm见方的小块，立即放入固定液中杀死固定，存于4℃冰箱固定12-24小时。此步骤于上一次实验课快要结束时进行，耗时10min左右。

技术要点：

固定的目的是利用化学药品将活细胞迅速杀死，使植物材料以保持固有形态和结构。所以，取材一定要新鲜、完整、快速，防止叶片失水过多，造成组织萎蔫变形，不利于观察。

卡诺固定液中的冰醋酸渗透力强而快，能溶解脂肪，可保存蛋白质不变质，是染色体很好的保存剂，组织发胀，可阻止酒精、甲醛等引起的收缩，采用注射器抽气可排除材料内气泡的干扰，加速固定液的渗透，更好的保存材料细胞的原有状态。

注意事项：

（1）应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。

（2）组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1cm×0.5cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。

（3）固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。

（4）注射器抽气时应注意，不可抽取过度，保持抽取状态30s，反复3次即可。

步骤2.清洗脱水

上午课时，上课教师指导学生将前一天实验课固定的材料70%酒精漂洗至无醋酸气味，再移到70%酒精，静置20min（期间经常晃动）。然后依次换80%酒精20min→95%酒精（加署红）20min→无水乙醇60min→无水乙醇60min→无水乙醇60min。此步骤需要耗时4课时，上课教师在实验间歇把本次试验的内容、步骤、注意事项和意义向学生讲解清楚。

技术要点：

脱水这一步至关重要，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行。而彻底脱水也是透明和浸蜡顺利进行的保证。

步骤3.透明浸蜡

下午课时，上课教师指导学生将材料依次更换：无水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→无水乙醇：二甲苯=1：1溶液 30min→无水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→100%二甲苯 20min→100%二甲苯 20min。然后加入与二甲苯等体积的的蜡片，置于42℃烘箱。本次实验耗时3课时，上课教师下课前要求学生晚9：00换蜡一次，换蜡后置于60℃烘箱，此后两天内上午和晚上各换蜡一次。

步骤4.包埋切片

上课时，上课教师先指导学生叠包埋用的纸船，然后进行包埋。包埋好的蜡块放事先预冷的冰水中，置于冰箱1h，然后进行授课，将本节课的实验内容跟大家讲解清楚，1h后取出进行修块、切片、贴片、展片、烤片后置于木质切片架于烘箱中烘片，本次实验共计耗时约3课时。

技术要点：

本实验采用石蜡取代透明剂二甲苯，使石蜡浸入组织并起支持作用。以石蜡为媒介，使植物组织达到一定的硬度，可以通过切片机切成8um厚的蜡带，将植物组织的结构清晰的呈现出来。

注意事项：

（1）包埋时顺时针轻轻摇晃盛有组织材料和石蜡的小瓶，将材料晃起，倒入纸船中，并将材料一字摆开，中间间隔适当的距离，然后将纸船底部慢慢浸入事先准备好的冷水中，不要完全浸没，双手捏紧纸船两端，直至表层石蜡凝固。动作要迅速，防止石蜡受冷凝固。

（2）包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，以利于下一步切片时形成蜡带。

（3）粘片剂明胶不能过量，过量反而不粘

（4）展片时蜡片的光面向下，不要滴加太多水，蜡带能够完全展开即可。

步骤4.染色封片

将烘好的片子通过染色盒进行二甲苯脱蜡，无水乙醇2min→无水乙醇 2s→70%酒精1min→30%酒精1min→蒸馏水1min逐级复水，钌红染色1min，再脱水透明，中性树胶封片。

上课教师指导学生在普通光学显微镜下观察制得的石蜡切片，观察植物叶片的植物叶片的组织结构，以及栅栏组织和海绵组织的区别，并绘制成图，作为本次试验的实验报告。本次课共计耗时3课时。

技术要点：

烘片后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。如果不经过复水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。

染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。本实验采用的钌红主要染细胞间层，配置简单，染色稳定，且染色时间短，颜色鲜明，不容易染色过度，染出来的切片植物组织结构清晰，便于普通显微镜观察。

注意事项：

（1）脱蜡及以后过程中，必须保证载玻片载有材料的一面，在玻片架上朝向一致。

（2）将载玻片从二甲苯中取出，务必使有材料的一面朝上。

（3）二甲苯极易挥发，载玻片从二甲苯中取出后要迅速滴胶，以免材料暴露于空气中，吸收的水分而导致实验失败。

（4）注意中性树胶的浓度，太稠时，用适量二甲苯稀释。

（5）胶的数量以刚好不溢出盖玻片为宜（200ul移液器滴加1滴）。

二、结论与分析

本实验共计耗时13课时，比较系统、连贯，而且步骤已简化，简单易操作，学生在短时间内就能够熟练掌握和操作。此方法将以前只能从书本上看到的植物显微结构，通过自己的双手亲自做出来，会使学生印象更加深刻。所以将石蜡切片技术应用在学校的本科教学中，具有深远意义。

实验教学在大学教学过程中占据重要位置，是理论教学外培养学生实践能力、创造能力的重要手段，也是辅助理论教学重要的一部分，实验教学使得课堂上讲的内容及方法能付于实践，加深和巩固课堂教学的内容。

目前，各大学校本科实验教学课程，普遍选用一些耗时短，简单的常规实验，但一般实用性不强。而石蜡切片技术在学生继续深造及今后的科研工作中大有裨益，所以在本科实验教学中广泛推广石蜡切片这门应用范围广、实用性强的常规技术在学校的本科教学中推广势在必行。

参考文献：

[1]侯春春，徐水.浅析影响石蜡切片质量的关键因素[J].中国农学通报，2009，25（23）：94-98.

[2]杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志，2006，23（1）：45-46.