白掌根腐病生防菌的筛选与鉴定

陈红彩，游 杏，丁 当，赵 冲，游春平

（仲恺农业工程学院农学院，广东 广州 510225）



白掌根腐病生防菌的筛选与鉴定

陈红彩，游 杏，丁 当，赵 冲，游春平

（仲恺农业工程学院农学院，广东 广州 510225）

摘 要：采用对峙培养法，从土壤中筛选出对白掌根腐病菌有拮抗作用的2株细菌菌株C3和S1；通过盆栽防治试验，结果显示2株拮抗细菌C3和S1对白掌根腐病的防效分别为55%和50%；通过16SrDNA序列分析，拮抗细菌菌株C3和S1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的序列相似性达99%；通过构建系统发育树，菌株C3与枯草芽孢杆菌在同一分支上，而菌株S1不在同一分支上。因此，初步将拮抗细菌菌株C3和S1分别鉴定为枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

关键词：白掌；根腐病；生防菌；鉴定

近年来，我国花卉种植规模越来越大，产业化水平越来越高，出现了多方位、多层次、多行业发展花卉的新局面。花卉产业已成为重要的农业支柱产业之一。然而，日趋严重的土传病害（如白掌根腐病、红掌根腐病、兰花根腐病和疫病等）已成为限制花卉产业发展和花农收入的一个重要因素。高档盆花是广东省花卉产业的优势花卉之一，在“十一五”期间发展迅猛，产值和出口创汇均位列花卉产业之首。国兰和红掌均势广东主栽的高档盆花，其中国兰种植面积达733.3 hm2，占国内国兰种植面积50%以上；红掌盆花年产约500万盆，约占全国红掌盆花总产量的60%。白掌盆花年产约400万盆，约占全国白掌盆花总产量的20%。据项目组前期调查，腐烂病是这两种盆花的重要病害，常造成植株黄化枯萎，发病严重的大棚发病率可达30%，给生产和花农收入造成严重影响。由于此病为土传病害，目前生产上主要通过化学农药处理栽培基质来防治。但是，由于可供使用的化学农药种类不多，长期反复使用导致病原菌抗药性增强，药剂防效降低、使用量增加。目前已有一些生防制剂用于农作物病害的防治，但还没有开发出用于花卉病害防治的生防制剂，因此开发出用于花卉病害防治的生防制剂具有重要的实现意义。

1　材料与方法

1.1 试验材料

BPDA培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂）配方参照龚国淑等的方法［1］；PDA和PD培养基配方参照方中达的方法［2］；白掌根腐病菌（Cyliadroclsdium sp.）由仲恺农业工程学院植物病理实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗细菌筛选 于仲恺农业工程学院校园中选取1 g土样，加入1 000 mL蒸馏水中。采用划线稀释法［3］，在含BPDA平板上进行分离、纯化，获得大量细菌菌株。将细菌菌株与白掌根腐病菌在PDA平板上进行对峙培养，挑选拮抗效果较好的拮抗细菌。

1.2.2 生防菌筛选 在PD培养液中震荡培养48 h的拮抗细菌喷淋于白掌苗（株高约20 cm）根部，对照为不喷淋拮抗细菌，每个处理3次重复，每个重复15株。培养48 h后再接种白掌根腐病菌（在小麦粒上培养7 d），将处理过的白掌盆栽苗置于28℃温室中培养，15 d后观察防治效果。

1.2.3 细菌菌株鉴定 将纯化的生防菌株送至上海立菲生物技术有限公司进行16S rDNA序列分析，将病菌16S rDNA序列在GenBank（登录http://.ncbi.nlm.nih.gov）中进行Blast比对，分析序列相似程度。利用MEGA4.0软件的Clustal W程序进行精确比对，采用Neighbor-joining法［4］，将GenBank中序列相似度较高的细菌与病原菌构建系统发育树，分析病原菌的归属。

2　结果与分析

2.1 生防菌筛选

从土壤中分离出C1、C2、C3、C4、S1等5个细菌菌株，并与白掌根腐病菌（Cyliadroclsdium sp.）进行对峙培养，结果显示，菌株C3与菌株S1对白掌根腐病菌生长具有明显的抑制作用。

在PD培养液中震荡培养48 h的拮抗细菌喷淋于白掌苗根部，培养48 h后再接种白掌根腐病菌，15 d后观察拮抗菌防治效果，结果显示，拮抗菌株C3和S1对白掌根腐病的防治效果分别为55%和50%。

2.2 生防菌株C3和S1的分子鉴定

2.2.1 生防菌株C3的分子鉴定结果 在GenBank上进行16S rDNA序列比对，与该菌株C3的16S rDNA序列（图1）相似度达99%的细菌均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或未定种的芽孢杆菌（Bacillus sp.），利用Genestar、DNASP和Mega5软件构建菌株C3与相关细菌16S rDNA的系统发育树，结果（图2）显示，菌株C3与枯草芽孢杆菌在同一分支上，因此，初步将菌株C3鉴定为枯草芽孢杆菌。

2.2.2 生防菌株S1的分子鉴定结果 在GenBank上进行16S rDNA序列比对，与该菌株S1的16S rDNA序列（图3）相似度达99%的细菌有8株枯草芽孢杆菌、1株龙舌兰芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）和2株未定种的芽孢杆菌（Bacillus sp.），利用Genestar、DNA-SP和Mega5软件构建菌株S1与相关细菌16S rDNA的系统发育树，结果显示，菌株C3与枯草芽孢杆菌和舌兰芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）不在同一个分支（图4），因此，初步将菌株C3鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

图1　菌株C3的16S rDNA序列

图2　病原菌菌株C3与相似种的16S rDNA分子系统发育树

图3　菌株S1的16S rDNA序列

图4　病原菌菌株S1与相似种的16S rDNA分子系统发育树

3　讨论

白掌根腐病是一种土传病害，这类病害难以防治，包括化学防治措施，而且化学药剂容易造成环境污染，因此开发环境友好、防效较高的生防制剂具有非常重要的现实意义。本研究获得对白掌根腐病防效分别为55%和50%的生防菌株C3和S1。关于细菌的鉴定方法，利用16S rDNA扩增测序技术鉴定细菌与其它细菌鉴定方法比较，具有高效、准确、简便、特异性强的优点，己成为微生物分类学中最重要的方法，但是同一属内不同种细菌的16S rDNA序列高度保守，有时仅仅根据16S rDNA序列相似性难以进行种水平上的鉴定，现在许多人通过构建系统发育树，对微生物在种水平上进行鉴定［5-8］。通过16S rDNA序列分析和构建系统发育树，初步将生防菌株C3和S1鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）。枯草芽孢杆菌作为生防菌已开发出许多产品，如Kodiak（GB03）、Subtilex（MBI600）、Serenade（QST713）和Taensa（FZB24），我国开发的亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁、康地蕾得等。近年来，国内外对于芽孢杆菌各方面应用的研究日益增多，枯草芽孢杆菌作为一种生防细菌越来越引起人们的关注［9-10］。而经研究发现，芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，许多性状优良的菌株表现出对多种植物病原菌的拮抗抑制作用［11］，对粮食、蔬菜和水果等病害有较好的防治效果［12］。本研究获得的生防菌株C3和S1在盆栽试验中具有一定的防治效果，但对于大田防治效果如何还有待进一步试验。

参考文献：

［1］ 龚国淑，张世熔，唐志燕，等.土壤芽孢杆菌分离方法的比较—— 以成都郊区土壤为例［J］.中国农业科学，2008，41（11）：3685-3690.

［2］ 方中达.植病研究法［M］.第3版.北京：中国农业出版社，1998.

［3］ 唐志燕，龚国淑，刘萍，等.成都市郊区土壤芽孢杆菌的初步研究［J］.西南农业大学学报，2005，27 （2）：188-192.

［4］ 冯思玲.系统发育树构建方法研究［J］.信息技术，2009（6）：38-44.

［5］ Lee I M.，Bartoszyk I M，GundersenRindal D E，et al.Phylogeny and classification of bacteria in the genera Clavibacter and Rathayibacter on the basis of 16S rRNA gene sequence analyses［J］.Applied and Environmental Microbiology， 1997， 63（7）：2631-2636.

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［7］ Drevinek P，Baldwin A，Dowson C G，et al.Diversity of the par B and rep A gens of the Burkholderia cepacia complex and their utility for rapid identification of Burkholderia cenocepacia［J］.Microbiology， 2008 （8）：44-54.

［8］ 褚晓玲，杨波.蝴蝶兰软腐病中一种新致病菌的分离与鉴定.植物病理学报，2010，40（1）：90-94.

［9］ 程亮，游春平，肖爱萍.拮抗细菌的研究进展［J］.江西农业大学学报，2003，25（5）：732-737.

［10］ 赵新林，赵思峰.枯草芽孢杆菌对植物病害生物防治的作用机理［J］.湖北农业科学，2011，50（15）：3025-3028.

［11］ 李晶，杨谦，赵丽华，等.生防枯草芽孢杆菌B29菌株抗菌物质的初步研究［J］.中国生物工程杂志，2008，28（2）：59-65.

［12］ 黄曦，许兰兰，黄荣韶，等.枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展［J］.生物技术通报，2010 （1）：24-29.

（责任编辑杨贤智）

Screening and identification of biocontrol bacteria against root rot of Spathiphyllum kochii caused by Cylindroclasdium sp.

CHEN Hong-cai， YOU Xing， DING Dang， ZHAO Chong， YOU Chun-ping

（College of Agronomy， Zhongkai University of Engineering and Agriculture， Guangzhou 510225，China）

Key words：Spathiphyllum kochii；root rot disease；biocontrol bacteria；identification

Abstract：Two antagonistic bacterial strains C3 and S1 against the pathogen of root rot of Spathiphyllum kochii were isolated from horticultural soil by using confront culture， their control efficiencies on root rot of S.kochii reached to 55% and 50%， respectively.Based on analysis of 16S rDNA sequences， similarity between strain C3 or S1 and Bacillus subtilis was 99.9%.Through construction of phylogenetic tree between antagonistic strains and their related strains from GenBank， strain C3 and Bacillus subtilis were on the same clade， but strain S1 and B.subtilis were not on a clade， so，antagonistic strain C3 and S1 were preliminarily identified as Bacillus subtilis and Bacillus sp.， respectively.

中图分类号：S482.2+92

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）01-0089-04

收稿日期：2015-09-21

基金项目：国家大学生创新基金（KK1133065）

作者简介：陈红彩（1994-），女，助教，E-mail：370549533@qq.com

通讯作者：游春平（1962-），男，博士，教授，E-mail：1309497194@qq.com