河南农村地区汉族2型糖尿病人群VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点基因多态性检测>*

蒋鸿琳，李　静，于　斐，巴　月，王重建，玉崧成，王　艳，赵林远，李文杰#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001　2)河南科技大学第一附属医院临床营养科 洛阳 471000　3)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001　4)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001

河南农村地区汉族2型糖尿病人群VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点基因多态性检测>*

蒋鸿琳1)，李静2)，于斐1)，巴月3)，王重建4)，玉崧成1)，王艳1)，赵林远1)，李文杰1)#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 4500012)河南科技大学第一附属医院临床营养科 洛阳 4710003)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 4500014)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001

关键词2型糖尿病；维生素D受体；单核苷酸多态性；河南；农村

摘要目的：探讨河南农村地区汉族人群维生素D受体(VDR)基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点基因多态性与2型糖尿病(T2DM)的关系。方法：采用RCR-RFLP技术检测河南省汉族人群中286例T2DM患者、286例健康对照VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点的多态性。分析2组间Apa Ⅰ和Taq Ⅰ等位基因、基因型和单倍体型分布与T2DM的关系。结果：2组间Apa Ⅰ等位基因频率差异有统计学意义(P=0.036)，T等位基因携带者患T2DM的风险是未携带者的1.328倍(95%CI=1.018～1.733)。2组间Taq Ⅰ等位基因和基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)。Apa Ⅰ和Taq Ⅰ之间存在连锁不平衡(D′=0.744)，其中，单倍体型Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT在病例组的分布频率高于对照组[χ2=7.313，OR(95%CI)=1.485(1.114～1.981),P<0.05]。结论：在河南农村汉族人群中，VDR基因Apa Ⅰ位点的等位基因T和单倍体型TT可能是T2DM的遗传易感因素。

糖尿病是全球性的公共卫生问题，预计到2030年全球糖尿病的患病人数将达4.39亿[1]。据2010年一项全国糖尿病患病率现况抽样调查结果[2]估计，中国成人糖尿病总数已达1.13亿，患病率高达11.6%。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是公认的由遗传与环境因素共同作用的代谢紊乱性疾病，遗传易感性对T2DM的发病机制十分重要[3-4]，目前已发现至少200多种基因与T2DM存在相关性。研究[5-7]发现维生素D是维持正常的胰岛素分泌和糖耐量所必需的物质，能影响胰岛β细胞的功能，在糖尿病的发生发展中发挥重要作用，其生物活性通过与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合而实现。VDR是一种配体激活的转录调节蛋白，与1,25-(OH)2D3结合后形成的复合物可特异性识别并结合靶基因上游调控区的DNA序列，从而调控下游基因的转录，产生一系列诸如调节钙磷代谢、促进细胞分化凋亡的生物学效应。近年来国内外多项研究[8-9]报道VDR基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与维生素D代谢水平、胰岛素敏感性和T2DM存在一定的关联。该研究选取VDR基因上常见的两个SNP位点Apa Ⅰ(rs7975232,G>T)和Taq Ⅰ(rs731236,T>C)，从基因水平进一步探讨VDR变异与河南农村地区汉族人群T2DM易感性的关系。

1对象与方法

1.1研究对象以村为单位，采用整群抽样的方法从河南省郑州市二七区侯寨乡、焦作市武陟县选取18～87岁汉族T2DM患者286人，相互间无亲缘关系，无其他自身免疫性疾病史，纳入病例组;依据WHO(1999年)糖尿病诊断标准，既往有T2DM史且正在进行降糖治疗，或2次空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，并排除1型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型糖尿病者[10]；研究同时排除此次调查中60岁以上新诊T2DM患者。对照人群选自和病例同一村民组、年龄±5岁、同性别、无相关慢性疾病或自身免疫性疾病者。相关研究设计经郑州大学伦理委员会审核通过，所有研究对象均知情同意。

1.2血样的采集与处理抽取研究对象空腹静脉血约10 mL，其中5 mL分离、分装血浆，采用全自动生化分析仪测定血浆葡萄糖水平； 5 mL抗凝血采用百泰克公司提供的DNA提取试剂盒提取人白细胞基因组DNA。

1.3VDR基因分型方法采用RCR-RFLP法。由于VDR两个SNP位点Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位于同一扩增片段上，因此二者共用一对引物。上游引物序列为5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’，下游引物序列为5’-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC-3’。取DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Mix 7.5 μL，超纯水4.5 μL，总反应体系15 μL。PCR扩增条件：94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环31次。扩增完成后，向反应体系中加入内切酶0.5 μL、Buffer 1 μL，混匀后Apa Ⅰ位点酶切体系于37 ℃水浴，Taq Ⅰ位点酶切体系于65 ℃水浴，反应3 h后，点样电泳，在凝胶成像系统中记录结果，分析Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点基因型。

1.4数据处理运用EpiData 3.0进行双人双录并核查。采用SPSS 21.0分析数据，对对照人群的基因型频数进行Hardy-Weinberg平衡检验，采用χ2检验分析病例组和对照组基因型分布，SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)进行等位基因关联度分析[以Lewontin′sD′值(D′)>0.7为有意义]和单倍体型分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1Hardy-Weinberg平衡检验结果Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点在对照人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.347和5.594，P均>0.05)。

2.2VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点基因型分析

Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点的PCR-RFLP电泳结果见图1、2。Apa Ⅰ位点PCR扩增产物酶切后有3种基因型，野生纯合型GG(528、217 bp)，突变杂合型GT(745、528、217 bp)，突变纯合型TT(745 bp)。Taq Ⅰ位点扩增产物酶切后有3种基因型，野生纯合型TT(494、251 bp)，突变杂合型TC(494、293、251、201 bp)，突变纯合型CC(293、251、201 bp)。

1：TT;2、6、7：GG;3～5、8：GT;9：Marker。图1　VDR基因Apa Ⅰ位点电泳结果图

1：TC;2：CC;3：TT;4：Marker。图2　VDR基因Taq Ⅰ位点电泳结果图

2.3VDR基因多态性与T2DM的关系结果见表1、2。由表1、2可知，两组基因型分布差异无统计学意义。Apa Ⅰ位点突变型等位基因T携带者患T2DM的风险是未携带者的1.328倍[OR(95%CI)=1.328(1.018～1.733)]。

表1　2组VDR基因Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点基因型的分布

表2　2组VDR基因

2.4等位基因关联度分析结果显示Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点间D′值为0.744，可以认为Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点之间存在连锁不平衡，且构成一个单倍体域。

2.5VDR基因单倍体型与T2DM的关系应用SHEsis在线软件对Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点可构建4种单倍体型(Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GC、GT、TC、TT)，系统默认频率3%以上为有意义的单倍体型，最终结果显示3种单倍体型有意义，即Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT、TC和TT。以Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GC作为参照进行比较，病例组中Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT的频率低于对照组，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT的频率在病例组中较高，提示Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT可能对T2DM具有保护性作用，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT与T2DM发病风险的升高存在关联性。见表3。

表3　病例组与对照组

3讨论

不同研究结果表明，VDR基因多态性存在种族和地区的差异。对于Apa Ⅰ位点，国内外多项研究[11-13]证实其多态性与葡萄糖耐量相关，而与T2DM的关系存在争议。APa Ⅰ位于第8内含子，其多态性不直接影响编码蛋白的氨基酸序列，但可能通过影响mRNA稳定性而影响VDR蛋白的合成[11]。该研究中ApaⅠ的基因型分布在病例组和对照组间差异无统计学意义，这与安徽地区的研究结果[14]相同，但等位基因频率分布差异有统计学意义，提示其等位基因T可能是河南汉族群体T2DM的易感基因，其多态性或与T2DM其他相关基因存在连锁不平衡。该研究结果还显示，在河南农村地区的汉族人群中，Taq Ⅰ位点不同基因型和等位基因频率在病例组和对照组中差异均无统计学意义，与宁夏地区的研究[15]结果相似。Taq Ⅰ位点位于第9外显子上，由于Taq Ⅰ多态性导致的是同义突变，编码的蛋白质并未产生变化，故可能并未影响合成的VDR蛋白与配体结合的功能。此外，对Apa Ⅰ和Taq Ⅰ位点等位基因的关联分析发现，二者间存在显著的连锁不平衡，构成的单倍体型Apa Ⅰ-Taq Ⅰ GT在对照组的频率分布高于病例组，而Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT在病例组的分布频率则更高，提示这两种单倍体型与T2DM密切相关，Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT可能是河南农村地区汉族人群T2DM的遗传易感因素。而单独分析时两者的基因型分布与T2DM均不存在相关性，说明Apa Ⅰ和TaqⅠ位点多态性对T2DM独立影响的作用较小，但可能通过基因间相互作用影响T2DM。单倍体型分析可能较单个SNP位点的分析更具说服力。

综上所述，河南农村地区汉族T2DM人群中VDR基因多态性和T2DM发病存在相关性；VDR基因Apa Ⅰ位点的等位基因T和Apa Ⅰ-TaqⅠ单倍体型TT可能是T2DM的遗传易感因素。在基因水平上的研究应更重视基因与基因间的联合作用。T2DM同时受到环境因素的影响，因此该研究为后续进一步探讨基因与环境的交互作用奠定了一定的基础。

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(2016-01-11收稿责任编辑徐春燕)

Detection of VDR gene Apa Ⅰ and Taq Ⅰ polymorphism in Han type 2 diabetes patients in Henan rural area

JIANGHonglin1),LIJing2),YUFei1),BAYue3),WANGChongjian4),YUSongcheng1),WANGYan1),ZHAOLinyuan1),LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofClinicalNutrition,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofScience&Technology,Luoyang4710003)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordstype 2 diabetes mellitus;vitamin D receptor;single nucleotide polymorphism;Henan Province;rural area

AbstractAim: To investigate the correlation of vitamin D receptor(VDR) gene at Apa Ⅰ and Taq Ⅰ with type 2 diabetes mellitus(T2DM) in Han population of rural area in Henan Province.Methods: PCR-RFLP method was carried out to examine the SNPs at Apa Ⅰ and Taq Ⅰ of VDR gene in 286 T2DM patients and 286 healthy controls in the Han population of Henan Province, then the distribution of allele, genotype and haplotypes between the two groups were compared.Results: The allelic frequencies of Apa Ⅰ had significant differences between the two groups(P=0.036). Individuals with allele T had a risk of 1.328 times as high as those without it(95%CI=1.018-1.733). However, the allelic frequencies and genotypic frequencies of Taq Ⅰ had no significant differences between the two groups(P>0.05). There was significant linkage disequilibrium between Apa Ⅰ and Taq Ⅰ(D′=0.744). The frequency of haplotype Apa Ⅰ-Taq Ⅰ TT was higher in the T2DM group than control group[χ2=7.313，OR(95%CI)=1.485(1.114-1.981),P<0.05].Conclusion: The allele T of Apa Ⅰ and the haplotype TT of Apa Ⅰ-Taq Ⅰ of VDR gene may be associated with higher T2DM susceptibility in Henan rural Han population.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.005

#通信作者，男，1958 年11月生，博士，教授，研究方向：营养相关慢性病，E-mail:lwj@zzu.edu.cn

中图分类号R587.1

*“973”计划前期研究专项2012CB526709；国家自然科学基金资助项目81573151，U1204823；河南省科技创新人才计划项目154200510010