靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建与鉴定>*

何玉婷，李　娟，孙冉冉，陈晓龙，申　珅，阚全程，余祖江#

1)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052　2)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052

靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建与鉴定>*

何玉婷1)，李娟1)，孙冉冉1)，陈晓龙1)，申珅1)，阚全程2)，余祖江1)#

1)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 4500522)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052

关键词HIF-1α；CRISPR/Cas9；肝细胞癌；载体构建；基因敲除

摘要目的：构建靶向低氧诱导因子(HIF)-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒，并体外鉴定其敲除效果。方法：设计靶向HIF-1α基因的gRNA序列，将其插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pCAG-T7中，转化后挑取克隆，进行测序验证。将构建好的重组质粒体外转染人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1，利用嘌呤霉素进行筛选并扩大培养获得HIF-1α基因敲除混合克隆细胞，应用Western blot技术检测未转染细胞和混合克隆细胞中HIF-1α蛋白的表达情况。结果：经测序验证，成功构建了靶向HIF-1α的重组质粒pCAG-T7-HIF-1α-gRNA，经Western blot验证，转染该重组质粒后人肝癌细胞株HepG2和SK-Hep-1经CoCl2诱导HIF-1α蛋白表达明显减弱。结论：成功构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒载体。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的恶性肿瘤，恶性程度高、进展迅速、预后差，是我国常见的恶性肿瘤之一，且发病率有逐年增高趋势[1]。因此，寻找新型的、有效的辅助治疗手段对提高HCC的总体生存率显得尤为重要[2]。低氧诱导因子(hypoxia induced factor,HIF)-1在缺氧条件下能激活多种缺氧反应性基因的表达, 是目前发现的惟一在特异性低氧状态下发挥活性的转录因子[3]。研究[4-5]表明，在前列腺癌、胰腺癌、脑瘤以及肝癌等多种肿瘤中均存在HIF-1α过表达,而在相应正常组织中无表达,提示HIF-1α的表达与肿瘤明显相关，HIF-1α通过调控下游基因的表达，参与并影响肿瘤细胞的重要生物学行为。相关研究[6]证实，HIF-1α表达水平与肝癌的发生发展具有密切关系，所以靶向HIF-1α的基因治疗策略可能成为HCC治疗的新的手段。

近年来兴起的CRISPR/Cas9技术具有强大的基因改造能力并且操作便捷，能够在体内外实现精确的基因编辑，其在基因编辑领域的应用日渐广泛[7]。因此，作者构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒载体，并利用其敲除人肝癌细胞中的HIF-1α基因，为进一步探索和证实HIF-1α与肝癌发生发展及预后之间的关系打下了基础。

1材料与方法

1.1主要试剂大肠杆菌DH5α感受态购自北京康为世纪生物科技有限公司，CRISPR/Cas9质粒骨架pCAG-T7购自北京唯尚立德公司，质粒提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司，转染试剂Easyfect购自无锡药科美生物科技有限公司。HIF-1α抗体购自美国Novus公司，氯化钴及其余化学试剂购自上海生工生物工程有限公司。

1.2靶向HIF-1α基因的gRNA的设计和合成根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，首先应用在线工具(http://crispr.mit.edu)设计出符合实验要求的gRNA，对其进行筛选及脱靶效应评估，挑选出特性强的gRNA。gRNA设计的主要原则[8]：3’端要有NGG碱基序列的20个连续的碱基序列，且不包括PAM序列；必须在外显子区域且选择靠前的外显子，以提高移码突变的概率；然后利用生物信息学软件进行全基因组比对，避免选择脱靶风险大的靶点序列，需考虑到gRNA效率以及染色体和核小体三维结构可能造成的空间位阻效应所致的Cas9无法结合的情况。同时选择出以下3个序列作为靶点序列(图1和表1)并进行体外筛选，以增加成功率和敲除效率。引物由上海生工生物工程有限公司合成。将3对gRNA引物稀释待用。

图1　靶向HIF-1α基因靶点位置示意图

引物名称引物序列(5-3)HIF-1α-gRNA-1-FAAACACCGTGCGTGTGAGGAAACTTCHIF-1α-gRNA-1-RCTCTAAAACGAAGTTTCCTCACACGCAHIF-1α-gRNA-2-FAAACACCGAACATAAAGTCTGCAACAHIF-1α-gRNA-2-RCTCTAAAACTGTTGCAGACTTTATGTTHIF-1α-gRNA-3-FAAACACCGTCCTCAGTCGACACAGCCHIF-1α-gRNA-3-RCTCTAAAACGGCTGTGTCGACTGAGGA

1.3pCAG-T7-HIF-1α-gRNA载体的构建及鉴定

质粒构建过程示意图见图2。PCR反应体系：10 μmol/L HIF-1α-gRNA-F、gRNA-R各1 μL，solutionⅠ5 μL，用ddH2O 稀释至10 μL。95 ℃反应3 min，95 ℃缓慢自然冷却至25 ℃，16 ℃反应5 min。然后将退火产物连接到载体中：pCAG-T7 1 μL，PCR反应产物2 μL，用ddH2O 稀释至10 μL，充分混合后，室温(25 ℃)静置 5 min。取连接产物5 μL加入到刚解冻的50 μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min后，42 ℃热激90 s，冰上静置2 min，直接涂于氨苄抗性的平板。第2天，挑选出生长状况良好的单菌落于20 mL含有氨苄抗性的LB培养液中，37 ℃ 200 r/min摇床培养过夜。取5 mL菌液送上海英潍捷基生物技术有限公司测序。

图2　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA重组载体结构示意图

1.4pCAG-T7-HIF-1α-gRNA对肝癌细胞的转染

按照试剂盒说明书提取阳性质粒，将3个构建好的重组质粒用TE buffer稀释至等浓度后等体积混合，测定浓度后待用。将处于生长状态良好的人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1(购自上海中科院细胞库)分别消化后接种至12孔板，融合达60%～80%时进行pCAG-T7-HIF-1α-gRNA转染。3个重组质粒各取2 μg，分别在聚苯乙烯管中与100 μL Opti-MEM®培养基混合成预混液，室温静置5 min后在预混液中加入2 μL Easyfect，轻轻吹打，摇晃混匀，室温孵育20 min。将配制好的DNA-脂质体复合物加入12孔板中，来回轻柔摇晃培养板，放入培养箱继续培养。转染24 h后,在荧光显微镜下观察细胞GFP蛋白表达情况，评估转染效率并拍照。转染36～48 h后加入含嘌呤霉素(HepG2和SK-Hep-1最优筛选浓度分别为2.0和1.5 mg/L)的无抗生素培养基,48 h后更换为最优筛选浓度一半的嘌呤霉素的新鲜无抗培养基维持10～15 d,筛选出基因敲除的混合克隆细胞株。

1.5细胞中HIF-1α蛋白的Western blot法检测用HIF-1α表达诱导剂CoCl2(200 μmol/L)诱导培养未转染的HepG2、SK-Hep-1以及混合克隆细胞24 h，提取蛋白，应用Western blot方法检测HIF-1α蛋白的表达，以相应条带灰度值表示表达水平。

2结果

2.1pCAG-T7-HIF-1α-gRNA的鉴定挑取的菌液经上海英潍捷基公司测序，所得序列与gRNA序列一致，测序比对结果见图3。

2.2pCAG-T7-HIF-1α-gRNA对HepG2、SK-Hep-1细胞的转染效果见图4。

2.3基因敲除效果Western blot结果见图5、表1。可以看出，未转染细胞经CoCl2处理后可见明显的HIF-1α表达，而基因敲除的混合克隆细胞HIF-1α表达明显减弱。

图3　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA测序结果

左:HepG2；右:SK-Hep-1。图4　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA转染效果图

A:HepG2；B:SK-Hep-1;1：未转染未诱导；2：未转染+诱导；3转染+诱导。图5　Western blot结果

表1　转染和未转染细胞中HIF-1α蛋白表达水平的比较

*:与HepG2或SK-Hep-1比较，P<0.05；与HepG2+CoCl2或SK-Hep-1+CoCl2比较，P<0.05。

3讨论

HIF-1是PAS(PER-ARNT-SIM)家族的成员之一,是一个以折叠-环-折叠为基础结构的转录因子家族，另外还包括结构相似的HIF-2和HIF-3。HIF-1为异源二聚体结构，由对氧含量敏感的HIF-1α亚基和结构性表达的HIF-1β亚基组成，通过与DNA结合发挥转录调节作用。HIF-1α亚基为特异性活性调节亚基，对氧的依赖性较强, 起到主要的缺氧调节作用。在常氧条件下，HIF-1α蛋白合成后会很快被降解，不发挥作用[9]。然而,在缺氧的情况下,HIF-1α的脯氨酰羟化被阻断,未被降解的HIF-1α进入细胞核, 与HIF-1β形成稳定的异质二聚体, 活化的HIF-1 在其靶基因的转录起始部位形成一个转录起始复合物, 从而启动对靶基因的转录，继而进一步发挥促进肿瘤细胞生长、侵袭、转移和化疗耐药的作用[10]。HIF-1α是介导生理性和病理性低氧反应的关键转录因子, 在缺氧环境中表达相对显著,活化的HIF-1作用于人类基因组的1%～2%基因,主要调节血管形成、细胞存活/死亡、代谢、pH、黏附、细胞外基质重塑、迁徙和转移等基因产物的表达，其表达与肿瘤的生长、浸润、转移和预后等密切相关, 并对肿瘤的治疗具有重要意义[11]。目前研究[6]表明, HIF-1在由肝脏炎性疾病向肝脏恶性肿瘤的演进过程中发挥着重要的作用，故推测 HIF-1有可能为肝癌的治疗提供新的靶点。为了进一步深入探索和研究HIF-1α在肝癌发生发展中的调控机制，该研究利用CRISPR/Cas9技术，在体外敲除人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1中的HIF-1α基因，并体外鉴定敲除效果。

CRISPR系统是由成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)和Cas基因(CRISPR-associated genes)组成的系统[12]。CRISPR系统的原理是基于gRNA 序列能够靶向识别与其互补的DNA 序列,并介导Cas9蛋白特异性地识别及切割该靶位点。同传统的siRNA和shRNA基因沉默技术相比，CRISPR/Cas9技术能够在基因水平实现对靶基因的敲除，更加稳定和彻底。与现有的其他基因编辑工具如锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)相比较，CRISPR/Cas9系统的载体构建更为简单和便捷，只需设计并改造载体上的目的基因的sgRNA序列即可，并且具备更强的扩展性[13]。

实验中，作者首先将设计好的能够靶向HIF-1α基因的gRNA序列连入gRNA-Cas9体系载体中，构建靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9表达载体。该重组质粒编码的Cas9蛋白带有的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)使其能够与gRNA片段结合并组装成gRNA-Cas9 复合体，在目标基因PAM元件的上游实现DNA双链的断裂，随后细胞利用自身的易错倾向的非同源末端连接(non-homologous end joining， NHEJ)修复，同源修复的过程中会在断裂位点产生插入或缺失，继而发生移码突变，导致靶基因编码的蛋白发生改变，从而达到基因敲除的效果。将构建成功的靶向HIF-1α的CRISPR/Cas9质粒转染至肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1中，利用抗性基因筛选获得HIF-1α基因敲除的混合克隆细胞，再进一步用Western blot法检测HIF-1α蛋白的表达情况。结果显示未转染细胞经CoCl2诱导后HIF-1α表达明显升高，而混合克隆细胞HIF-1α未见明显表达，提示HIF-1α基因敲除成功。

该研究成功构建了靶向HIF-1α的CRISPR/Cas9质粒载体，为下一步体内外水平敲除HIF-1α基因，进一步研究其在肝癌发生发展过程中的作用打下了前期基础。

参考文献

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[12]CONG L,RAN FA,COX D,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819

[13]MA YZ,HUANG X.Genome modification by CRISPR/Cas9[J].FEBS J,2014,281(23):5186

Construction and indentification of CRISPR/Cas9 plasmid targeting HIF-1α gene

HEYuting1)，LIJuan1)，SUNRanran1)，CHENXiaolong1)，SHENShen1)，KANQuancheng2)，YUZujiang1)

1)DepartmentofInfectionDiseases，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofPharmacology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsHIF-1α；CRISPR/Cas9；hepatocellular carcinoma；vector construction；gene knock-out

AbstractAim: To construct CRISPR/Cas9 knock-out plasmid targeting HIF-1α gene, and identify its knock-out effect in vitro.Methods: The gRNA sequences targeting HIF-1α gene were designed,then were inserted into CRISPR/Cas9 plasmid skeleton vector pCAG-T7,which was transformed into competent DH5α.The single clone was picked up and validated via sequencing. Then the constructed recombinant vector pCAG-T7-HIF-1α-gRNA was transfected into HepG2 and SK-Hep-1, and the HIF-1α gene knock-out mixed colony cell were selected using puromycin. Subsequently, the expression level of HIF-1α in the HIF-1α gene knock-out mixed colony cell lines was detected by Western blot. Results: Through the sequencing validation, the plasmids targeting HIF-1α gene was successfully constructed. The expression levels of HIF-1α in HepG2 and SK-Hep-1 transfected with the recombinant vector were significantly reduced.Conclusion: CRISPR/Cas9 plasmid targeting HIF-1α gene has been successfully constructed.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.002

#通信作者，男，1971年5月生，教授，博士生导师，研究方向：重症肝炎和肝癌的综合治疗，E-mail:johnyuem@zzu.edu.cn

中图分类号Q781

*河南省科技厅创新人才基金项目124100510010；郑州大学第一附属医院青年基金项目(2013年)