不同贮藏温度下马铃薯发芽期激素变化规律及抑芽剂配置研究

李成，王玉萍,2,刘悦善，程李香

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃 兰州　730070；2.甘肃农业大学园艺学院,甘肃 兰州　730070)



不同贮藏温度下马铃薯发芽期激素变化规律及抑芽剂配置研究

李成1，王玉萍1,2,刘悦善1，程李香1

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃 兰州730070；2.甘肃农业大学园艺学院,甘肃 兰州730070)

摘要：【目的】 控制贮藏期马铃薯发芽来提高种薯质量和节约贮藏成本.【方法】 采用以‘大西洋和夏波蒂’2个品种的微型薯为材料，在4、10、20 ℃ 3种不同贮藏条件下贮藏120d后，统计发芽率，测定块茎内赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和生长素(IAA)含量.【结果】 随着贮藏温度的降低，马铃薯发芽率显著下降，在4℃贮藏条件下，夏波蒂与大西洋的ABA含量分别为119 ng/g和143 ng/g，而在20 ℃和10 ℃贮藏条件下，检测不到ABA.GA3含量也随着贮藏温度的降低显著下降，在4℃贮藏条件下，‘夏波蒂’和‘大西洋’的GA3含量分别低于20℃贮藏条件下66%和58%；在4 ℃贮藏条件下，夏波蒂和大西洋IAA含量分别低于20 ℃贮藏条件下83%和86%； 【结论】 ABA是抑制马铃薯发芽的主要激素因素.在此基础上配制以ABA结合H2O2的抑芽剂，并使用该抑芽剂对大西洋和夏波蒂微型薯进行抑芽，测定施用抑芽剂后的內源激素含量.结果表明ABA∶H2O2(3%)∶C2H5OH(5%) = 0.1 g∶0.1 L∶0.9 L配比下施用的发芽率下降幅度最大， ABA含量最高，GA3和IAA含量最低，为良好的抑芽剂配方.

关键词：马铃薯；脱落酸(ABA)；赤霉素(GA3)；高效液相色谱(HPLC)；双氧水(H2O2)

马铃薯块茎的后熟阶段完成后，便转入休眠，当经过一段时间贮藏后进入发芽.在生产中不适当的发芽和休眠都会造成很大损失.目前,我国的马铃薯贮藏设备比较简陋，贮藏技术不高，贮藏损失率高达20%～30%.由于贮藏不当使得马铃薯品质下降，尤其是加工品质严重下降，极大影响了马铃薯的商品率.而且，萌芽后的马铃薯淀粉含量下降，品质低并且在芽眼部位产生龙葵素，当龙葵素的含量超过0.02%时，会引起不同程度的人畜中毒.

马铃薯休眠受块茎中内源激素的促进和抑制作用来共同调控[1-4].赤霉素(GA3)普遍被认为是生长促进剂，脱落酸(ABA) 则抑制发芽[5].内源ABA被认为对块茎休眠起维持作用，当块茎形成时内源ABA增加并能够抑制块茎茎尖生长，随着休眠的解除和茎尖的开始生长，ABA含量迅速减少[6-9].研究者认为内源ABA是马铃薯离体块茎休眠的主要调控內源激素[10].马铃薯休眠结束时，块茎内ABA含量降低，这导致ABA与GA的比值降低，这是块茎发芽的主要原因.以外源ABA施用来提高内源ABA含量是降低马铃薯贮藏期发芽率的理想方法.H2O2是很好的活体渗透剂,能够携带激素进入植物体内，而且H2O2可以及时分解休眠期马铃薯块茎内所形成的活态GA3，实现抑芽的目的.目前，我国马铃薯贮藏技术主要以低温贮藏为主，阐明马铃薯低温贮藏下马铃薯块茎内部生理生化的变化规律，根据生理规律来设计降低马铃薯贮藏期发芽率的抑芽剂，使贮藏期马铃薯按照生产要求发芽，对提高马铃薯贮藏技术具有重要意义.本试验通过测定不同贮藏温度下马铃薯的发芽率及内源激素含量的测定，在探明不同贮藏温度下马铃薯块茎内源激素变化规律的基础上，采用不同ABA和H2O2浓度配比的抑芽剂处理不同温度贮藏的马铃薯块茎，以期获得抑芽剂的最适配比，为马铃薯贮藏技术的改良提供理论依据.

1材料与方法

1.1试验材料

本试验以马铃薯品种‘夏波蒂’和‘大西洋’的微型薯种薯为试验材料，由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供.

1.2试验方法

1.2.1微型薯繁育微型薯繁育参照《马铃薯三代种薯体系与种薯质量控制》和《马铃薯种薯原原种繁育技术规程》[11-12].将带一个叶节脱毒试管苗茎段接种到50 mL MS固体培养基(MS+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH 5.8)三角瓶，每瓶扦插6～8个茎段.培养温度(23±1) ℃，光照时间16 h/d，光照强度2 000 lx，培养25 d后.选择株高5 cm、3叶以上组培苗移栽至蛭石中，采用自然光照射，温度22～25 ℃，相对湿度95%，每7～10 d浇水或营养液一次，培养20周左右收获微型薯，用无菌去离子水冲洗数次，滤纸吸干微型薯表面水分.选取质量在(5±0.5)g，无病害、无损伤微型薯种薯为试验材料，分别置于温度为4 、10 和20 ℃的黑暗条件下(相对湿度(80±5)%)，贮藏0、30、60、90、120 d后取样，测定GA3、IAA和ABA含量，记录不同贮藏温度下各时间段块茎发芽率.一般认为马铃薯块茎休眠通过的标志是发芽率达到50%以上，且至少有一个芽长度在2 mm以上[13].

1.2.2马铃薯内源激素的提取及含量测定微型薯种薯内源激素提取方法参照文献[14-15]中方法.称取微型薯块茎(以芽眼为中心直径1 cm处)0.5～1 g，加液氮研磨成粉末，加0.5 mL丙醇/水/浓盐酸(2∶1∶0.002,V/V/V)混合溶液，4 ℃震荡30 min.加1 mL二氯甲烷，4 ℃震荡30 min，5 000 r/min离心10 min，取下清液，残渣加0.5 mL二氯甲烷洗涤并再次离心，合并下清液.下清液过预先活化的C18柱(6 mL甲醇活化，再用5 mL 80%甲醇平衡).过滤后用1 mL 80%甲醇洗脱，收集两次洗脱液冷冻干燥，加200 μL甲醇/5%甲酸水溶液(1∶1，V/V)溶解，0.45 μm滤膜过滤，滤液用于高效液相色谱(HPLC)测定.所用色谱柱：Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶水=15∶20∶65(V/V/V)，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，检测波长210 nm，进样量20 μL.

1.2.3不同抑芽剂配比处理微型薯选取休眠60 d后未发芽微型薯，在培养皿底铺垫圆形滤纸，用蒸馏水浸湿，用棉球蘸取不同配比的抑芽剂(抑芽剂配方和配比如表1)擦拭对应培养皿中的微型薯芽眼，然后将其分别放置于 4、10、20 ℃的暗室中培养60 d后进行发芽率统计及內源激素ABA、GA3、IAA含量的测定.

表1　马铃薯抑芽剂配比设计表

1.3数据分析

2 结果与分析

2.1不同贮藏温度对微型薯发芽率的影响

低温贮藏可以抑制马铃薯微型薯的萌发，延长马铃薯休眠期.在20 ℃贮藏条件下，‘夏波蒂’在45～50 d左右通过休眠，贮藏至90 d时发芽率达到100%，休眠完全解除.‘大西洋’在35～40 d左右通过休眠，70 d左右发芽率达到100%，‘大西洋’完全打破休眠所需时间较‘夏波蒂’少20 d；在10 ℃贮藏条件下，‘夏波蒂’60 d左右通过休眠，110 d左右休眠完全解除，发芽率达100%.‘大西洋’休眠时间与‘夏波蒂’相近，而完全解除休眠时间比‘夏波蒂’提前10 d左右；在4 ℃贮藏条件下，贮藏120 d后，2个品种的发芽率均未达到50%，休眠未完全解除(图1).

2.2不同贮藏温度对內源激素含量的影响

为分析低温贮藏条件抑制马铃薯萌发的机理，试验中分别对‘夏波蒂’和‘大西洋’在20、10、4 ℃条件下贮藏120 d后的GA3、IAA、ABA含量进行测定(图2).‘夏波蒂’和‘大西洋’微型薯GA3含量随贮藏温度的下降呈下降趋势，‘夏波蒂’在4 ℃贮藏条件下GA3含量低于20 ℃贮藏条件下66%，‘大西洋’4 ℃贮藏条件下GA3含量低于20 ℃贮藏条件下58%；在10℃贮藏条件下，‘夏波蒂’和‘大西洋’的GA3含量分别低于20 ℃贮藏条件下36%和45%.2个品种IAA含量也随贮藏温度的下降呈下降趋势，‘夏波蒂’在4 ℃贮藏条件下IAA含量低于20 ℃贮藏条件下83%，‘大西洋’4 ℃贮藏条件下IAA含量低于20 ℃贮藏条件下86%；在10℃贮藏条件下，‘夏波蒂’和‘大西洋’的IAA含量分别低于20 ℃贮藏条件下27%和65%.2个品种在20 ℃和10 ℃贮藏条件下均未出现ABA，而在4 ℃贮藏条件下，‘夏波蒂’与‘大西洋’的ABA含量分别为119 ng/g和143 ng/g.

小写字母表示在不同贮藏条件下差异显著(P<0.05).下同.图1　不同贮藏时间和温度下微型薯发芽率Fig.1　Sprouting percentage of minituber under different storage days and temperatures

图2　不同贮藏温度下内源激素的含量Fig.2　The content of endogenous hormone under different storage temperatures

2.3不同抑芽剂配比处理下的发芽率

T2配比抑芽剂处理使10 ℃和20 ℃条件下的马铃薯发芽率显著下降(图3).在20 ℃条件下，T2配比抑芽剂处理‘夏波蒂’与‘大西洋’发芽率分别低于对照79%、77%，2个品种在T3和T4处理下发芽率均有所上升，但仍低于对照.在10 ℃条件下，T2配比抑芽剂处理‘夏波蒂’与‘大西洋’发芽率分别低于对照78%、76%.T3和T4处理2个品种的发芽率表现为上升趋势.在4 ℃条件下，‘夏波蒂’与‘大西洋’的发芽率在各个处理间均无显著差异.

2.4不同抑芽剂配比处理对內源激素ABA含量的影响

在施以抑芽剂处理后不同温度下的块茎內源ABA含量均有不同程度增加，在T2处理下均达到最大值，且呈显著水平(图4).在10 ℃与20 ℃条件下，T2处理夏波蒂与大西洋內源ABA含量与对照相比均显著上升并达到最高，T3、T4处理ABA含量开始下降，但仍高于对照水平.在4 ℃条件下，在施以不同配比抑芽剂后两个品种块茎ABA含量均有所上升，但并未达到显著水平，且维持较高水平.

图中CK代表蒸馏水处理，T1代表抑芽剂配比为ABA∶3%H2O2∶5%C2H5OH = 0.05 g∶0.15 L∶0.85 L，T2代表抑芽剂配比为ABA∶3%H2O2∶5% C2H5OH = 0.1 g∶0.1 L∶0.9 L，T3代表抑芽剂配比为ABA∶3%H2O2∶5% C2H5OH=0.2 g∶0.075 L∶0.925 L，T4代表抑芽剂配比为ABA∶3% H2O2∶5% C2H5OH=0.4 g∶0.05 L∶0.95 L.下同.图3　不同配比抑芽剂处理下微型薯发芽率Fig.3　Sprouting percentage of minituber under different inhibition buds solvent proportions treatment

图4　不同配比抑芽剂处理下內源激素ABA含量Fig.4　The content of endogenous IAA under different inhibition buds solvent proportions treatment

2.5不同配比抑芽剂处理对內源激素GA3含量的影响

在不同温度下，施以不同配比抑芽剂后‘夏波蒂’与‘大西洋’內源激素GA3含量均在T2处理时最低(图5).在20 ℃条件下，T2处理时‘夏波蒂’与‘大西洋’內源激素GA3含量分别低于对照64%、58%，T3、T4处理时ABA含量均有不同程度上升.在10 ℃条件下，‘夏波蒂’与‘大西洋’內源激素GA3含量均在T2处理时最低，并与对照相比呈显著水平.在4 ℃条件下，‘夏波蒂’与‘大西洋’內源激素GA3含量在各个处理下均无显著变化，且维持较低水平.

2.6不同配比抑芽剂处理对內源激素IAA含量的影响

在不同配比抑芽剂处理下‘夏波蒂’与‘大西洋’內源激素IAA含量与对照相比均呈下降趋势(图6).在20 ℃与10 ℃条件下，在不同配比抑芽剂处理‘夏波蒂’与‘大西洋’IAA含量均下降明显， 4 ℃条件下变化不显著.在T2处理下20 ℃和10 ℃‘大西洋’IAA含量下降最为显著.‘夏波蒂’20 ℃和10 ℃下IAA含量下降最显著的处理分别是T4和T2.

图5　不同配比抑芽剂处理下內源激素GA3含量Fig.5　The content of endogenous GA3 under different inhibition buds solvent proportions treatment

图6　不同配比抑芽剂处理下內源激素IAA含量Fig.6　The content of endogenous IAA under different inhibition buds solvent proportions treatment

3讨论与结论

马铃薯块茎收获后进入休眠状态，即使在合适的发芽条件下，短期内也不能发芽，必须经过一段时间的休眠后才能萌芽生长[16-17].这种休眠状态受多种因素控制，如环境中的光照、温度和湿度，但这些外部因素是通过块茎的内源因素来起作用的，内源因素中激素是控制马铃薯块茎休眠及萌芽的主要因素.关于内源激素对块茎休眠的调控，研究倾向于抑制因子/促进因子平衡调节休眠，即当某种因子占优势时，块茎就表现该因子所控制的性状，这和种子休眠的调节模式相一致[18-19].也就是说，块茎中ABA和GA之间存在着某种平衡关系，这种平衡关系随着储藏时间及条件的变化而改变[20].在贮藏过程中，由于GA3、ABA 和IAA 合成并滞留在块茎中，可以用于测定并作为贮藏参数的指标.国内马铃薯微型薯种薯生产在每个季节和月份都有收获，研究中选用4 ℃、10 ℃和20 ℃下2个品种微型薯种薯进行內源激素测定，其中高温贮藏条件下较低温条件下块茎中GA3含量高.主要原因可能是微型薯休眠解除过程中，其内源GA3含量需要达到休眠解除的水平.而微型薯内源ABA 含量随着贮藏温度升高其含量显著下降，说明ABA 也是主要参与马铃薯休眠调控的激素.

与高温贮藏条件相比，低温贮藏下GA3含量显著下降，而ABA含量则逐渐升高.这表明贮藏温度的高低是影响马铃薯内源激素变化的主要因素，GA3含量升高是打破马铃薯休眠的主要因素,ABA则是保持马铃薯休眠状态的主要因素.这种ABA/GA含量比的平衡关系主要受环境因素调控并最终体现在块茎发芽率上.依据这种平衡关系并以H2O2作为活体渗透剂配置抑芽剂.在H2O2含量较高的条件下，外源施用是内源ABA含量显著增加，而且显著提高了ABA/GA3的比值，此外还抑制GA3和IAA含量，这个结果说明ABA的提高是由于外源的影响，而GA3和IAA含量的下降可能是H2O2含量对部分芽眼部分细胞的伤害作用和前体信号作用导致的结果，这种伤害应该同时能够降低内源ABA含量，但由于外源的施用ABA，所以在总的ABA含量上显示出增加的结果.

通过对不同贮藏温度下马铃薯內源激素GA3、IAA、ABA和发芽率的测定，获得控制马铃薯块茎发芽调控的控制性激素因素和其平衡变化规律，在此基础上以渗透剂H2O2和ABA的不同配比获得抑芽剂并得到最适配比浓度.

参考文献

[1]Van Ittersum M K.Relation between growth conditions and dormancy of seed potatoes Ⅲ：Effects of light[J].Potato Research,1992,35(4):377-387

[2]Van Ittersum M K,Scholte K.Relation between growth conditions and dormancy of seed potatoes Ⅱ：Effects of temperature[J].Potato Research,1992,35(4):365-375

[3]Donnelly D J,Coleman W K,Coleman S E.Potato microtuber production and performance:A review[J].American Journal of Potato Research,2003,80(2):103-115

[4]Dogonadze M Z,Korableva N P,Platonova T A,et al.Effects of gibberellin and auxin on the synthesis of abscisic acid and ethylene in buds of dormant and sprouting potato tubers[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2000,36(5):507-509

[5]Hartmans K J,Van Es A.The influence of growth regulators GA3,ABA,kinetin and IAA on sprout and root growth and plant development using excised potato buds[J].Potato Research,1979,22(4):319-332

[6]Kumar G N,Lulai E C,Suttle J C,et al.Age-induced loss of wound-healing ability in potato tubers is partly regulated by ABA[J].Planta 2010;232(6):1433-1445

[7]Destefano-Beltran L,Knauber D,Huckle L,et al.Effects of postharvest storage and dormancy status on ABA content,metabolism,and expression of genes involved in ABA biosynthesis and metabolism in potato tuber tissues[J].Plant Molecular Biology 2006;61(4-5):687-697

[8]Baudo M M,Meza-Zepeda L A,Palva E T,et al.Induction of homologous low temperature and ABA-responsive genes in frost resistant (Solanumcommersonii) and frost-sensitive (Solanumtuberosumcv.Bintje) potato species[J].Plant Molecular Biology 1996;30(2):331-336

[9]Suttle J C,Abrams S R,De Stefano-Beltran L,et al.Chemical inhibition of potato ABA-8'-hydroxylase activity alters in vitro and in vivo ABA metabolism and endogenous ABA levels but does not affect potato microtuber dormancy duration[J].Journal of Experimental Botany 2012;63(15):5717-5725

[10]Cornforth J W,Milborrow B V,Ryback G,et al.Identification of the yellow lupin growth inhibitor as (+)-abscisin II ((+)-dormin)[J].Nature,1966,211(5050):742-743

[11]谢开云,何卫.马铃薯三代种薯体系与种薯质量控制[M].北京:金盾出版社,2011:1-28

[12]甘肃省质量技术监督局.DB62/T 1704-2009 马铃薯种薯原原种繁育技术规程[S].2009

[13]康朵兰.马铃薯大西洋块茎在休眠萌发和低温贮藏期的生理生化变化[D].长沙:湖南农业大学,2007

[14]Pan X,Welti R,Wang X.Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J].Phytochemistry,2008,69(8):1773-1781

[15]程建新,毕阳,田世龙,等.高效液相色谱法同时测定马铃薯块茎中的GA3、IAA ABA含量[J].甘肃农业大学学报,2013,48(2).1003-4315

[16]Hemberg T.Potato rest.In:P.H.Li (Eds.),Potato Physiology.New York:Academic Press,1985:352-388

[17]Claassens M MJ,Verhees J,van der Plas L H W,et al.Ethanol breaks dormancy of the potato tuber apical bud[J].Journal of Experimental Botany,2005,56(419):2515-2525

[18]Suttle J C.The role of endogenous hormones in potato tuber dormancy.Dormancy in plants:from whole plant behaviour to cellular control[M].New York:CABI Publishing,2000:211-226

[19]Aksenova N P,Sergeeva L I,Konstantinova T N,et al.Regulation of potato tuber dormancy and sprouting[J].Russian Journal of Plant Physiology,2013,60(3):301-312

[20]刘悦善,李成,王东霞,等.加工型马铃薯品种微型薯种薯贮藏期内源激素含量、阈值和休眠期相关性分析[J].中国农业科学,2015,(2),0578-1752

(责任编辑李辛)

Hormones change regularity of potato tubers during germination period and suckering agent preparation

LI Cheng1,WANG Yu-ping1,2,LIU Yue-shan1,CHENG Li-xiang1

(1.Gansu Key Laboratory of Crop Genetic & Germplasm Enhancement,Lanzhou 730070,China;2.College of Horticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 Controlling sprout of storage potato can improve the quality of seed potato and save storage cost.【Method】 In this experiment,the microtubers of two potato varieties,Atlantic and Shepody were used as experimental materials.The contents of endogenous phytohormones GA3,IAA and ABA in minitubers of two cultivars were determined during storage for 120 d at three temperatures (4 ℃,10 ℃ and 20 ℃).【Result】 The germination rate was reduced greatly along with the storage temperature decreasing in two cultivars.The ABA content of Shepody and Atlantic were 119 ng/g and 143 ng/g at 4 ℃ storage temperature,respectively.However,the content of ABA was not detected at 20℃ and 10 ℃ storage.The content of GA3 reduced along with the storage temperature decreasing.The GA3 content in Shepody and Atlantic were decreased by 66% and 58% under 20 ℃ storage conditions,respectively.The content of IAA in Shepody and Atlantic decreased by 83% and 86% under 20 ℃ storage conditions,respectively.The present results indicated that the endogenous phytohormones ABA was the main hormone factors to inhibit the germination rate of the potato tuber.The inhibitor of tuber sprouting were deployed on the basis of ABA with H2O2 and were used to treat the minitubers.【Conclusion】 The results show that the lowest germination rate were observed under the ABA∶H2O2 (3%)∶ C2H5OH (5%)=0.1 g∶0.1 L∶0.9 L,and the content of ABA was highest,the content of GA3 and IAA were the lowest.The result suggested that the changes in the level of dynamic balance of endogenous phytohormones GA3,IAA and ABA in minitubers were affected by the storage period and temperature.

Key words：potato;abscisic acid；hydrogen peroxide；optimum；sprouting rate

通信作者：王玉萍，女，副教授，博士，主要从事植物逆境生理研究.E-mail：wangyp@gsau.edu.cn

基金项目：甘肃省农业厅生物技术专项(GNSW-2008-07)；甘肃省基础研究创新群体(1308RJIA005)；国家国际科技合作专项(2014DFG31570)；甘肃省高校基本科研业务费；甘肃省自然科学基金项目(1506RJZA013)；国家自然科学基金项目(31260094).

收稿日期：2015-04-13；修回日期：2015-04-29

中图分类号：S532

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)02-0040-07

第一作者：李成(1989-)，男，硕士研究生，主要从事植物蛋白质组学研究.E-mail：licheng891210@126.com