肿瘤增殖相关分子(TSPAN-1)和血管内皮生长因子C（VEGF-C）在宫颈鳞癌中的表达及意义

王惠芬 毛熙光

肿瘤增殖相关分子(TSPAN-1)和血管内皮生长因子C（VEGF-C）在宫颈鳞癌中的表达及意义

王惠芬 毛熙光

目的 通过检测肿瘤增殖相关分子(TSPAN-1)和血管内皮生长因子C（VEGF-C）在正常宫颈（NCE）组织、宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈鳞癌（SCC）组织中的表达情况，探讨两者在宫颈鳞癌发生、发展中的作用及意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测15例NCE组织，30例高级别CIN组织及

45例SCC组织中TSPAN-1和VEGF-C的表达情况，分析两者的表达与宫颈癌患者各临床因素的关系。结果 TSPAN-1和VEGF-C在正常宫颈组织中均不表达；在CINI I+CINI II级、宫颈鳞状细胞癌组织中两者的表达明显升高。TSPAN-1在宫颈鳞癌的阳性表达率与患者年龄、FIGO分期、组织分化程度无关，与淋巴结转移和宫颈浸润深度有关（P＜0.05）。VEGF-C在宫颈鳞癌组中的阳性表达率与患者年龄、FIGO分期无关，而与宫颈浸润深度、组织分化程度、淋巴结转移有关（P＜0.05）。宫颈鳞癌组织中TSPAN-1和VEGF-C的表达呈正相关（r＝0.851，P＜0.05）。结论 TSPAN-1和VEGF-C在正常宫颈组织的表达均明显低于宫颈上皮内瘤变组、宫颈鳞癌组中的表达。在宫颈鳞癌组中TSPAN-1的阳性表达率与年龄、FIGO分期、组织分化程度无关，而与间质浸润深度及淋巴结转移相关。VEGF-C在宫颈鳞癌组中的阳性表达率与年龄、FIGO分期无关，而与浸润深度、组织分化程度、淋巴结转移密切相关。TSPAN-1及

VEGF-C在宫颈鳞癌中的表达呈正相关，说明两者可能与宫颈鳞癌的发生、发展相关。

宫颈鳞癌；肿瘤增殖相关分子(TSPAN-1)；血管内皮生长因子C（VEGF-C）；免疫组织化学

宫颈癌是我国常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率呈年轻化和上升趋势。近年来宫颈癌的诊治技术不断提高，但是对于宫颈癌的有效治疗方法仍存在诸多问题，最主要的原因是宫颈癌的转移，这是宫颈癌死亡的主要原因之一。

肿瘤增殖相关分子TSPAN-1(tetraspanin-1)又称为C 4.8、P 503 s或者NET-1，它是四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily，TM 4 SF)的成员之一[1]。国内外的研究表明TSPAN-1在多种人类肿瘤组织中呈高表达，TSPAN-1可与细胞内外分子相互作用，促进肿瘤细胞的增殖、浸润，加速肿瘤的进展[2]。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)，是VEGF家族的新成员。VEGF-C通过与其受体VEGFR-3、VEGFR-2结合，促进淋巴管内皮细胞分化、增殖和迁移，进而促进淋巴管的生成，还能刺激血管内皮细胞增生和移动，增加血管的通透性[3]。研究还发现TSPAN-1在卵巢癌组织中通过合成和分泌VEGF-C，促进淋巴管和微血管的生成，从而促进肿瘤的浸润和淋巴转移[4]。由此部分学者推测：TSPAN-1和VEGF-C与肿瘤的浸润和淋巴转移可能具有协同作用。本研究拟采用免疫组织化学的方法检测TSPAN-1和VEGF-C在宫颈癌中的表达，分析TSPAN-1和VEGF-C在宫颈鳞癌发生、发展中的作用和意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 组织标本及相应临床资料的收集 标本来源：泸州医学院附属医院妇科2012年4月～2014年6月手术切除的存档组织蜡块，正常宫颈组织15例（来自于子宫脱垂或子宫肌瘤行子宫切除术的子宫颈组织）;高级别宫颈上皮内瘤变（CIN）30例（CINⅡ15例，CINⅢ15例，标本来源于宫颈锥切或阴道镜下活检的子宫颈组织）;宫颈鳞癌45例，其中患者年龄30～58岁，＞35岁组（n=40）和≤35岁组（n=5），平均年龄（44.5±4.2）岁；按FIGO分期（2009年版）：Ⅰ期18例(其中Ia期1例,Ib期17例)，Ⅱ期27例（IIa期25例，IIb期2例）；有淋巴结转移者15例，无淋巴结转移者30例；组织分化程度：高分化15例，中分化15例，低分化15例；浅肌层浸润者（浸润深度＜1/2）有13例，深肌层浸润者(浸润深度≥1/2)有32例。所有宫颈癌病例均行广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结切除术，术后病检证实为宫颈癌。术前均未进行放射治疗或化学药物治疗。

1.1.2 主要实验试剂 鼠抗人单克隆TSPAN-1抗体（美国USCN公司），兔抗人VEGF-C多克隆抗体（武汉生物科技有限公司）。

1.1.3 主要实验仪器 OLYMPUS BX-53光学显微镜（日本Olympus公司），图像采集系统（德国Leica公司），显微镜摄像系统(AH型)(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 采用免疫组织化学法SP法 所有标本均经10%福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规脱蜡、下行梯度酒精中脱苯、水化，抗原修复，采用SP法免疫组织化学染色、DAB显色、苏木素复染，中性树胶封片。显微镜下观察。

1.2.2 对照设置 (1)阴性对照：用PBS代替一抗作为阴性对照，结果阴性。(2)阳性对照：采用肝癌组织切片作为阳性对照，结果阳性。

1.3 结果判定

1.3.1 TSPAN-1的阳性判读标准 TSPAN-l定位于细胞质或细胞膜,阳性表达呈棕黄色颗粒状染色。表达水平按每张片子取阳性染色较多的区域，计数5个高倍镜视野(×200)中TSPAN-1阳性表达的细胞所占的百分比，取其均值＜50%的细胞表达为阴性，≥50%的细胞表达为阳性[5]。

1.3.2 VEGF-C的阳性判读标准 VEGF-C的判定以细胞胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性。高倍镜下(400×)对每张切片，随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞。按每张切片阳性细胞比例及着色深浅计分，行半定量分析。阳性细胞所占比例判断：无着色0分，1/3以下着色为1分，1/3～2/3为2分，2/3以上为3分。阳性强度：无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项相乘≤2者，记为阴性(-)；两项相乘≥3者，记为阳性(+)[6]。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验或Fisher’s精确概率法；两种蛋白表达的相关性比较采用Spearman相关分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSPAN-1

2.1.1 TSPAN-1在不同类型宫颈组织中的表达情况TSPAN-l在15例正常宫颈组织中不表达，在30例高级别的

CIN中和45例宫颈鳞癌组织中均有较高的表达，其阳性表达率分别为66.67%、57.78%，但CINⅡ～CINⅢ级及宫颈鳞癌2组比较其阳性表达率差异无统计学意义（χ2＝0.036，P＞0.05）。

2.1.2 TSPAN-l的表达与宫颈鳞癌患者临床病理学特征的关系 TSPAN-l在年龄≤35岁组和年龄＞35岁组中的阳性表达率分别为60.00%和55.00%，其差异无统计学意义。在45例宫颈鳞癌中临床分期为I期的18例，TSPAN-l蛋白阳性表达率为61.11%；临床分期为II期的27例，TSPAN-l蛋白阳性表达率为51.85%，2组差异无统计学意义（χ2=0.375，P＞0.05）。TSPAN-l蛋白在高分化组和中、低分化组宫颈鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为53.33%、56.67%，2组的阳性表达率差异无统计学意义（χ2=0.045，P＞0.05）。TSPAN-l蛋白在15例有淋巴结转移组中，其阳性表达率为80.00%；在30例无淋巴结转移组中，其阳性表达率为43.33%；两者的阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。45例宫颈癌中浅肌层浸润（浸润深度＜1/2）13例，深肌层浸润（浸润深度≥1/2）有32例，TSPAN-l在浅肌层浸润和深肌层浸润组中，阳性表达率分别为30.77%、65.63%，2组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 TSPAN-l的表达与宫颈鳞癌临床病理学特征的关系

2.2 VEGF-C

2.2.1 VEGF-C在不同宫颈组织中的表达 VEGF-C在15例正常宫颈组织中均不表达；在30例CINII～III级中，阳性表达率为70.00%；在45例宫颈鳞癌中，阳性表达率为68.89%，但是CIN II+CIN III级组和宫颈鳞癌组比较，差异无统计学意义（χ2=0.10，P＞0.05）。

2.2.2 宫颈鳞癌中VEGF-C的表达与临床病理学特征的关系VEGF-C在年龄＞35岁组，年龄≤35岁组中的阳性表达率分别为67.50%和80.00%，2组比较差异无统计学意义。在45例宫颈鳞癌中临床分期为I期的18例，VEGF-C蛋白阳性表达率为77.78%；临床分期为II期的27例，VEGF-C蛋白阳性表达率为62.96%，2组差异无统计学意义（χ2=1.106，P＞0.05）。VEGF-C蛋白在高分化组和中、低分化组宫颈鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为46.67%、80.00%，差异有统计学意义（P＜0.05）。VEGF-C蛋白在有淋巴结转移的15例中，阳性表达率为93.33%；在30例无淋巴结转移组中，阳性表达率为56.67%,差异有统计学意义（P＜0.05）。45例宫颈癌中浅肌层浸润（浸润深度＜1/2）13例，深肌层浸润（浸润深度≥1/2）有32例，VEGF-C在浅肌层浸润和深肌层浸润组中，阳性表达率分别为38.46%、81.25%，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 VEGF-C的表达与宫颈鳞癌临床病理学特征的关系

2.3 TSPAN-1和VEGF-C在宫颈鳞状细胞癌中表达的相关性分析 根据TSPAN-1和VEGF-C在45例宫颈鳞癌组织中的表达情况，两者均为阳性有20例，均为阴性有9例；TSPAN-1阳性表达，而VEGF-C阴性表达有5例；TSPAN-1阴性表达而VEGF-C阳性表达有11例；采用Spearman等级相关性分析，宫颈鳞癌组织中TSPAN-1与VEGF-C的表达呈正相关（r＝0.851，P＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是妇科肿瘤中最常见的一种恶性疾病，严重威胁女性健康，其发病率仅次于乳腺癌，位于女性恶性肿瘤的第2位。目前虽然对宫颈癌的发生、发展进行了大量研究，也取得了不少成果，但宫颈癌的转移常常不可避免，其转移方式主要是直接蔓延和淋巴转移，即使早期的宫颈癌也可发生淋巴结转移，这将严重影响患者的预后。

研究发现，TSPAN-1与肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移、浸润和诱导血管形成有密切关系，并对判断肿瘤预后有一定的意义[7]。TSPAN-1基因位于染色体1 p 34.1，其mRNA全长为12 97 bp，有241个氨基酸的开放阅读框，编码序列为128-853 bp[8]。TSPAN-1是一种具有四跨膜结构域的糖蛋白，包含两个细胞外结构域和一个小的细胞内环；其中，细胞外结构域由两个亚结构域构成，其主要功能是结合胞外配体或蛋白；细胞内环的主要功能是结合细胞骨架和细胞内信号分子[9]。TSPAN-1具体的表达调控机制尚不明确，目前的研究认为，TM 4 SF能与膜内、跨膜及膜外蛋白结合，发挥连接膜内外信号通道的作用,直接或间接作用于细胞的信号转导通道从而影响细胞的各种生命活动。

张璇等[10]和Wollscheid[11]的研究发现，TSPAN-1在正常宫颈组织中不表达，在CINⅠ中几乎不表达，但是TSPAN-1在高级别CINⅡ和CINⅢ中的阳性表达率逐渐增高，但是在CINⅢ和宫颈癌中的阳性表达率差异无统计学意义，说明TSPAN-1的高表达可能是宫颈癌发生的早期分子事件。本研究结果显示，TSPAN-l在正常宫颈组织中不表达，在高级别的CIN中和宫颈鳞癌组织中均有较高的表达，与前述研究结果相似，这可能提示：TSPAN-1蛋白在宫颈癌的发生、发展过程中，当致癌因子作用于子宫颈上皮细胞使其发生异型性改变后，它可能作为一种膜蛋白和胞浆蛋白转导细胞分裂信号或引起细胞去分化或者异向分化，并在CIN细胞表面积聚，可能协同产生肿瘤细胞生长因子，刺激肿瘤增生，直至宫颈癌的发生。另外张璇等[10]的研究还发现TSPAN-1在有淋巴结转移组的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，说明TSPAN-1与癌细胞的浸润和转移相关，但与宫颈癌临床分期、肿瘤大小及组织学分级均无关。本研究结果显示，TSPAN-1的表达与淋巴结转移和浸润深度有关，这与前述研究结果有相符。这可能提示TSPAN-1可能与细胞内外分子相互作用，转导细胞分裂信号，引起肿瘤细胞向周围侵袭、并使血管增生，增生的血管为肿瘤细胞提供了良好的生长环境，进而加速细胞的增殖及对局部组织的侵袭；同时肿瘤细胞表面集聚的TSPAN-1可能协调产生肿瘤生长因子，促进肿瘤细胞的增殖，加速肿瘤的进展[2]。

VEGF-C是最近发现的与淋巴转移密切相关的生长因子。VEGF-C在成人体内主要表达于淋巴结、心脏、小肠、胎盘、卵巢和甲状腺等器官组织[12]。VEGF-C有两种受体：VEGFR-3和VEGFR-2。VEGFR-3主要调节淋巴管的生成，VEGFR-2主要调节血管增生和血管通透性。VEGF-C与VEGFR-3结合使得后者发生磷酸化激活，继而激活多条细胞内信号传导通路，导致淋巴管内皮细胞增殖、分化、迁移、抗凋亡等重要的生物学行为。最终，在细胞外基质和淋巴管内皮细胞的相互作用下形成新生淋巴管。VEGF-C与受体VEGFR-2结合，刺激血管内皮细胞增生和移动，导致血管的通透性增加[3]。VEGF-C与受体VEGFR-2结合，还可通过PI 3 K途径，激活抗调亡蛋白，并上调凋亡蛋白，抑制肿瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤细胞的生长[13]。

目前有研究[6,14-15]表明在正常宫颈上皮中VEGF-C表达呈阴性，而在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ三者之间的阳性率表达差异有统计学意义，CINⅢ和宫颈鳞癌之间差异无统计学意义。本研究结果显示，VEGF-C蛋白在正常宫颈组织中均不表达；在CINⅡ～CINⅢ级组和宫颈鳞癌组中阳性表达率明显升高，但是CINⅡ+CINⅢ级组和宫颈鳞癌组比较，无明显差异。这与前述研究结果有相符，结果可能提示：在宫颈癌的发生初期VEGF-C与VEGFR-3结合导致p 44/p 42 MAPK 磷酸化激活，从而引起生长相关基因的转录、翻译、修饰及细胞凋亡因子的失活，促进细胞增殖，导致肿瘤的发生。另外Jeltsch等[16]的实验表明，VEGF-C转基因小鼠中VEGF-C高表达，而且能特异性诱导淋巴管内皮的增殖和淋巴管增生。Tanaka等[17]的实验表明，肿瘤分期高的食管癌患者其VEGF－C表达水平明显高于分期低的患者，VEGF-C高表达者较低表达者更容易发生淋巴转移，并且其生存期也比低表达者明显缩短。本研究结果发现VEGF-C在宫颈鳞癌组中的阳性表达率与年龄、FIGO分期无关，而与浸润深度、组织学分级、淋巴转移密切相关（P＜0.05），这与前述的研究均表明VEGF-C的高表达与肿瘤的淋巴结转移有关。这可能与VEGF-C与其受体VEGFR-3结合所诱导的淋巴管内皮细胞增殖、迁移有关；另外VEGF-C与受体VEGFR-2结合，刺激血管内皮细胞增生和移动，导致血管的通透性增加，且新生的毛细淋巴管内皮细胞缺乏紧密连接和基底膜，有利于癌细胞从内皮细胞间隙进入淋巴管，淋巴管数目越多，癌细胞进入淋巴管的机会就越大，癌细胞进入淋巴管和淋巴结后通过与内皮细胞壁的粘附作用向管腔内壁靠近，在淋巴管内向阻力低的方向移动，逐步浸润蔓延，与周围组织粘连、固定，导致淋巴管腔的阻塞和淋巴结受累。正常的淋巴引流受阻后可建立淋巴管侧支循环，癌细胞通过侧支循环扩散，导致肿瘤的浸润和转移[3]。

本研究结果显示，TSPAN-1和VEGF-C在宫颈鳞癌中的表达水平呈正相关关系，这提示可能与TSPAN-1通过合成和分泌VEGF，共同促进淋巴管和微血管的生成有关；另外VEGF-C促进血管增生为肿瘤细胞的增殖提供了丰富的血供，加速肿瘤的进展。

综上所述，TSPAN-1及VEGF-C在宫颈鳞癌中均呈高表达，并且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关，推测两者可能共同作用促进宫颈癌细胞的增殖、血管增生及淋巴管的形成，从而促进宫颈癌的进展，但具体的分子机制尚不明确。进一步研究两者的分子调节机制，可能为宫颈癌的发生、发展的深入研究提供一定的指导意义，为宫颈癌的早期诊断、早期治疗提供理论依据。

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Objective To study the expression of tetraspanin-1 and vascularendothelial growth factor-C in the normal cervical epithelium (NCE), cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and squamous carcinomas of cervix (SCC), and to investigate the relationship of TSPAN-1 and VEGF-C in the occurrence and development of squamous carcinomas of cervix. Methods Immunohistochemistry SP was employed to detect the expression of TSPAN-1 and VEGF-C in 45 cases of SCC, 30 cases of high level CIN and 15 cases of NCE. This study was to explore the relationships between the two kinds of protein expression and the clinical pathological parameters of SCC. Results In the process of normal cervix to the cervical intraepithelial neoplasia to cervical squamous cancer, the expression of TSPAN-1 and VEGF-C increased gradually. The positive expression rates of TSPAN-1 were not associated with clinical pathological index of SCC such as age, FIGO stages, historical differentiation, but associated with the depth of tumor invasion and lymph node metastasis. The positive expression rates of VEGF-C in SCC were not associated with clinical pathological index of SCC such as age, FIGO stages, but associated with historical differentiation, the depth of tumor invasion and lymph node metastasis. The expression level of TSPAN-1 and VEGF-C in cervical squamous cancer were positively correlated. Conclusion The expression of TSPAN-1 and VEGF-C in the cervical tissue of different research object; in the process of normal cervix to the cervical intraepithelial neoplasia to cervical squamous cancer the expression of TSPAN-1 and VEGF-C increased gradually, but the positive expression level of TSPAN-1 and VEGF-C in cervical squamous Cancer have non-significant higher than it in the cervical intra-epithelial neoplasia．There was no correlation between the expressions of TSPAN-1, VEGF-C and the pathoclinical parameters, including the age, FIGO stages, but associated with the depth of tumor invasion and lymph node metastasis in SCC. The expression of TSPAN-1 was correlated with that of VEGF-C in SCC.

Squamous carcinoma of cervix; Tetraspanin-1; Vascularendothelial growth factor-C; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.15.001

四川 644000 宜宾市翠屏区妇幼保健院 （王惠芬） 646000 四川医科大学 （毛熙光）