藏红花球茎组织培养条件的研究

李　涛,李春斌,范圣第

(1.大连民族大学 国家民委-教育部生化工程重点实验室，辽宁 大连 116605；2.中美华世通(武汉)生物医药科技有限公司，湖北 武汉 430070)



藏红花球茎组织培养条件的研究

李涛1,2,李春斌1,范圣第1

(1.大连民族大学 国家民委-教育部生化工程重点实验室，辽宁 大连 116605；2.中美华世通(武汉)生物医药科技有限公司，湖北 武汉 430070)

摘要：以藏红花球茎侧芽为外植体，通过植物组织培养的方式建立藏红花快速繁殖体系。研究表明：以MS为基本培养基，附加0.5 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-12,4-D，在黑暗条件下最适于藏红花愈伤组织的诱导，并且20 d诱导率可以达到96.7 %；附加2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，在黑暗条件下最适合藏红花丛生芽的诱导与增值，丛生芽诱导率可达96 %；附加5.0 mg·L-16-BA +1.5 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1AC，在1 500～2 000 lx的光照条件下，30 d左右新生小球茎诱导率高达90 %。

关键词：藏红花；组织培养；愈伤组织；小球茎

藏红花(CrocussativusL.)，别名番红花、西红花，属于鸢尾科番红花属多年生草本植物。藏红花原产于西班牙、希腊、南欧各国以及伊朗等地[1]，后经印度传到中国，如今在江浙和华北都有种植[2]。在治疗精神类疾病、神经退行性疾病、学习记忆障碍、心血管方面显示出潜在的药用价值[3-4]。由于藏红花只能依靠球茎无性繁殖，并且在种植过程中随着繁殖代数的增加球茎越来越小，小球茎开花少且较小，甚至不开花，从而失去了药用价值[5]。藏红花仅仅是柱头入药，但因适合其种植的地域有限且种植条件苛刻等因素，以致其产量极低，来源极为有限，价格昂贵。应用植物组织细胞培养的方法能够很好地解决藏红花种球病毒积累、品质退化、繁殖系数低甚至失去药用价值等问题。

本实验以藏红花球茎侧芽为外植体，从不同培养条件上研究藏红花愈伤组织、丛生芽和小球茎的发生，探索出一条人工繁殖藏红花球茎的途径，以期提高藏红花的繁殖系数，解决球茎退化、资源短缺等问题。

1材料与方法

1.1材料

本实验室藏红花球茎来自于大连市，取材时间为当年的5月底，此时的球茎正处于休眠期。基本培养基分别为MS、1/2MS、N6、B5培养基；激素分别为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸( 2,4-D )、α-萘乙酸 (NAA)、玉米素(ZT)。

1.2方法

1.2.1培养基的配制

分别以MS、1/2MS、N6和B5为基本培养基，所有的固体培养基中均添加30 g·L-1的蔗糖和6.5 g·L-1的琼脂，调pH为5.8～6.2，根据实验的需要添加6-BA、2,4-D、NAA、ZT和AC等其他附加物后分装到培养小瓶中，最后在121 ℃下灭菌15 min备用。

1.2.2外植体的消毒方法

以保存于4 ℃冰箱中8周的休眠藏红花球茎为外植体，在流水冲洗下去掉球茎表面的泥土和皮膜，剔除清洗不干净的病斑后，将其中已萌发的芽连同球茎一起切下，在流水下冲洗过夜。在已通过紫外除菌的洁净工作台上将藏红花球茎和侧芽转入到75 %乙醇灭菌1min，再转入0.1 %～0.2 %的升汞或5 %次氯酸钠中，消毒5～20 min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸去多余的水分，备用。每瓶接种3个外植体，3种不同的消毒方式分别接种10瓶，一周后观察不同的消毒剂对藏红花染菌率的影响。

1.2.3接种及愈伤组织诱导

在无菌操作台上将已消毒处理好的球茎侧芽切成1 cm左右的小段,分别将其接种到添加了0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D的MS、1/2MS、N6和B5培养基中，分别附加不同的激素，并在不同温度下进行暗培养，观察研究4种不同的基本培养基与藏红花愈伤组织诱导的关系，同时筛选出适合诱导愈伤组织的最佳培养基。

1.2.4丛生芽诱导与继代培养

将上述经继代培养获得的愈伤组织切块后分别转接到添加了0～3 mg·L-16-BA和NAA与添加了0～3 mg·L-1ZT和NAA的MS基本培养基中，在优化温度和黑暗条件下进行丛生芽的诱导。培养一个月后，观察统计藏红花愈伤组织芽的分化情况，筛选出最适合藏红花愈伤组织分化出芽的培养基。利用优化的培养基，在优化的温度条件下分别以暗培养、光照培养和1 500～2 000 lx与16 h·d-1光照的方式进行藏红花愈伤组织丛生芽的诱导。将诱导出的丛生芽在优化的条件下进一步继代培养。

1.2.5球茎诱导培养

取经继代增殖培养后的丛生芽分别转接到添加了0～5 mg·L-16-BA和NAA的MS+0.3 g·L-1AC培养基中观察活性炭存在下激素对球茎诱导的作用，再向上述优化的培养基中添加0～1 g·L-1AC，观察活性炭质量浓度对球茎诱导的作用，且均在优化温度、1 500～2 000 lx和14 h·d-1光照下培养。

2结果与分析

2.1培养基对愈伤组织诱导的影响

采用4种不同的培养基来进行藏红花愈伤组织的诱导，筛选出藏红花愈伤组织诱导的最佳培养基，结果见表1。

表1　基本培养基对愈伤组织诱导的影响

由表1可发现,当以N6为基础培养基时愈伤组织的诱导率为0 %，以1/2MS和B5为基础培养基时愈伤组织的诱导率都相对较低，以MS为基础培养基时愈伤组织的诱导率为83.3 %，表明最适合藏红花愈伤组织诱导的是MS培养基，这也与MS培养基是目前使用最普遍的培养基，具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长特点相吻合。

2.2不同消毒方法与外植体染菌率的关系

实验以不同浓度的消毒剂处理不同的时间来研究不同的消毒方法对藏红花离体培养染菌率的影响。统计结果见表2。

表2　不同消毒方法对外植体染菌率的影响

经分析发现,在相同时间下不同消毒剂对染菌率的影响，氯化高汞的灭菌效果相对比次氯酸钠好；在相同的消毒剂下处理不同的时间，其灭菌效果差异显著。经LSD法分析，处理时间在6 ，8，10 min时，灭菌效果差异非常显著，而在10 min和15 min时灭菌效果不十分明显。当以升汞处理时间为6～10 min时，外植体的染菌率高达50.0 %以上， 10～15 min时，其染菌率可降低到20 %左右。然而从愈伤组织诱导率和消毒剂对外植体的伤害来看，并不是处理的时间越长越好，当0.1 %升汞或0.2 %升汞处理时间超过15 min后，部分外植体出现病变腐烂现象，从而导致其不能正常地诱导出愈伤组织，因此降低了愈伤组织的诱导率。综合考虑愈组织诱导率和外植体的染菌率，认为以75 %乙醇消毒1 min外加0.1 %升汞消毒10 min的组合方式来处理藏红花组织培养中的外植体较为合适。

2.3培养温度对愈伤组织诱导的影响

通过将外植体接种到相同的无菌培养基中，利用光照培养箱在(16±0.3) ℃、(18±0.3) ℃、(20±0.3) ℃、(22±0.3) ℃和(24±0.3) ℃下培养1个月，统计结果见表3。

表3　温度对愈伤组织诱导的影响

温度过高或过低都不利于藏红花愈伤组织的快速诱导和诱导率的提高，研究结果表明，愈伤组织的最佳诱导温度为(20±0.3) ℃，因此本实验选择(20±0.3) ℃作为藏红花愈伤组织的诱导最佳温度。

2.4激素对愈伤组织诱导的影响

将球茎侧芽接种于以MS为基本培养基且添加了不同质量浓度和配比的6-BA和2,4-D中，利用光照培养箱，在培养温度为(20±0.3) ℃和黑暗条件下培养10 d左右，外植体切口处开始张裂，有颗粒状的物质出现时，再连续培养20 d左右后形成黄色颗粒状的愈伤组织(如图1)。

图1　藏红花球茎侧芽愈伤组织的诱导

通过接种后一个月的观察，记录统计结果见表4。在仅仅添加2,4-D时不能成功的诱导出愈伤组织，其诱导率为0 %。当存在定量的6-BA协同作用时，2,4-D质量浓度过高或过低都不利于愈伤组织诱导率提高和愈伤组织快速诱导，同时6-BA质量浓度过大也不利于藏红花愈伤组织诱导率的提高。研究结果表明，藏红花愈伤组织诱导的最适激素配比为0.5 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-12,4-D，其中藏红花愈伤组织诱导率为96.7 %。

表4　不同激素组合对藏红花愈伤组织诱导的影响

2.5激素对丛生芽诱导的影响

将已形成的愈伤组织中生长状态相对一致的转接到附加了不同质量浓度激素配比的分化培养基中，利用光照培养箱在(20±0.3) ℃和暗培养条件下进行藏红花无菌丛生芽的诱导培养。在培养过程中发现，除了形成愈伤组织外，逐渐有些突起形成白色披针形的叶片，慢慢形成丛生芽(如图2)，将丛生芽进一步继代培养以后得到更多的丛生芽(如图3)。

图2　藏红花愈伤组织分化出丛生芽

通过对愈伤组织分化培养一个月的观察，统计结果(见表5)表明，当较高质量浓度的6-BA与较低质量浓度的NAA相互协同作用时，能成功诱导出藏红花丛生芽，但是6-BA的质量浓度太高或NAA的质量浓度太低对丛生芽的诱导都不利，其中6-BA 与ZT相比更有利于丛生芽的诱导，当激素配比是2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA时,藏红花的丛生芽诱导率最高，且最高可达到96 %。

图3　藏红花的继代增值

激素配比/(mg·L-1)外植体数/个外植体平均出芽数/个出芽率/%6-BA3+NAA0.23015506-BA3+NAA0.33020676-BA3+NAA0.43012406-BA3+NAA0.53010336-BA2+NAA0.33016536-BA2+NAA0.5302896ZT2+NAA0.530930

2.6光照对丛生芽诱导的影响

本实验均在暗培养条件下进行藏红花愈伤组织的诱导，为了确定光照是否对藏红花丛生芽的诱导有影响，又研究了光照对丛生芽诱导的影响，结果见表6。

表6　光照时间对藏红花愈伤组织分化成芽的影响

表6结果表明，在暗培养条件下丛生芽的诱导率可高达95 %，但是在光照的培养条件下丛生芽的诱导率明显降低，最高只能到达30 %，说明光照不利于藏红花愈伤组织进一步诱导丛生芽。

2.7藏红花球茎的诱导条件

2.7.1激素对球茎诱导的影响

通过50 d的球茎诱导培养，探讨不同质量浓度的激素配比对球茎诱导的影响，结果见表7。在不添加任何激素的MS培养基中，芽不能正常生长，更不能诱导出小球茎；在仅添加1.0 mg·L-16-BA或1.0 mg·L-1NAA的MS培养基中，丛生芽生长十分缓慢且相对矮小，最终都不能诱导出小球茎。研究表明，球茎诱导的最佳激素配比为5.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA，球茎诱导最快，且能正常生长，第30 d球茎诱导率为90 %。

表7　激素对藏红花球茎诱导的影响

2.7.2活性炭与藏红花试管球茎诱导的关系

考察了当以MS为基本培养基，结合球茎诱导最佳激素配比5.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA 的条件下，不同质量浓度的活性炭对藏红花球茎诱导的影响，结果见表8。在不添加活性炭的情况下，即使培养基到第65 d，球茎的诱导率依旧为0 %；而在添加了0.3 g·L-1活性炭的培养基中，藏红花小球茎的诱导时间最短为30 d且诱导率最高可达90 %(如图4)。

表8　活性炭对藏红花试管球茎诱导的影响

图4　藏红花球茎

3讨论

有关藏红花的组织培养，最近国内外有报道利用SH和LS等作为基础培养基[6-11]，但是利用常用的MS作为基础培养基并附加与本实验不同的激素浓度配比时也能诱导出丛生芽和小球茎，可见外源激素的类型与浓度配比是藏红花快速繁殖是否成功的关键。其中国内外多以藏红花球茎为外植体来进行组织培养，然而，关于以藏红花球茎侧芽为外植体来进行组织培养的报道较少。本文以藏红花球茎侧芽为外植体，建立了藏红花球茎的快速繁殖体系，成功诱导出了藏红花愈伤组织且分化出丛生芽，由丛生芽进一步诱导培养后成功获得了球茎，并且其诱导率均高于国内外的相关报道。

在藏红花愈伤组织诱导过程中，以MS为基础培养基时愈伤组织的诱导率都相对比以1/2MS和B5为基础培养基时高，其中原因可能是MS培养基中的硝酸盐和铵的含量较高，更有利于藏红花球茎愈伤组织的诱导，并且与陈书安[12]等研究结果一致。实验结果表明，只有当细胞分裂素和生长激素的协同作用时才能诱导出藏红花愈伤组织。此外，当存在定量的6-BA协同作用时，2,4-D质量浓度过高或过低都不利于愈伤组织诱导率提高和愈伤组织快速诱导，同时6-BA质量浓度过大也不利于藏红花愈伤组织诱导率的提高。本实验中愈伤组织20 d能达到96.7 %的诱导率，均高于国内外相关愈伤组织诱导的研究[13-16]。与Zeybek[14]等研究结果相比，藏红花愈伤组织诱导率均显著提高，但与Raja[16]等的研究相比，延长了藏红花愈伤组织的诱导时间，其中可能原因是与外植体的来源不同有关。以细胞分裂素和生长激素协同作用来决定细胞的分裂和生长，在藏红花球茎诱导中起着决定性的作用，在仅含6-BA或2,4-D的培养基中，小球茎诱导率都较低或不产生小球茎。在藏红花球茎诱导过程中，可以利用活性炭对激素的吸附和解吸附来调控培养基中的激素水平[17]，同时能通过吸附培养基灭菌时产生的糖裂解产物、植物分泌的酚类等抑制生长的物质[17]，促进藏红花试管球茎的诱导。

关于直接以藏红花花柱为外植体的快速繁殖，有待进一步的研究，以实现在最短的时间内直接获得更多的藏红花药用成分。

参考文献：

[1] 陈文浩,欧元, 赵兵,等. 番红花球茎的快速高频诱导[J]. 过程工程学报，2007,7(1):129-130.

[2] 李琳琳.藏红花的研究概述[J] .中山大学研究生学刊, 2008,29(2): 46-51.

[3] 王平,童应鹏,陶露霞,等.西红花的化学成分和药理活性研究进展[J].中草药,2014,45(20):3015-3028.

[4] CARLO I G. Tuberoso, ANTONELLA Rosa, PAOLA Montoro,et al.Antioxidant activity, cytotoxic activity and metabolic profiling of juices obtained from saffron (Crocus sativus L.) floral by-products[J].Food Chemistry,2016,199(15): 18-27.

[5] 董峰丽,饶君凤,毛碧增.西红花组织培养研究进展[J].药物生物技术,2013,20(1):91-94.

[6] 陈书安,王晓东, 欧阳杰，等.藏红花球茎愈伤组织快速诱导的研究[J].中国药学杂志,2003,38(4):254-256.

[7] 袁丽红,陆玉婷,黄晶.藏红花球茎愈伤组织诱导和褐化抑制[J].南京工业大学学报(自然科学版),2009,31(6):21-26.

[8] SIVANESAN I, JANA S, JEONGIN B R. Vitro shoot regeneration and microcorm development in crocus vernus hill[J]. Pakistan Journal Botany,2014,46(2)：693-697.

[9] MIR J I, AHMED N,WANI S H, et al. In vitro development of microcorms and stigma like structures in saffron (Crocus sativus L.)[J]. Physiol Mol Biol Plants,2010,16(4):369-373.

[10] SHARMA K D, RATHOUR R, SHARMA R, et al. In vitro cormlet development in Crocus sativus[J]. Biologia Plantarum, 2008,52(4): 709-712.

[11] 朱保华.番红花离体快繁及无病毒植株的培育[D].重庆:西南大学,2009.

[12] 陈书安,王晓东,赵兵,等.藏红花的研究进展[J].中草药,2001,32(12):1137-1139.

[13] 彭海君. 西红花生物学特性、离体快繁及质量评价研究[D].浙江:浙江农林大学,2014.

[14] ZEYBEK E, ÖNDE S, KAYA Z.Improved in vitro micropropagation method with adventitious corms and roots for endangered saffron[J]. Central Eur J Biol, 2012,7(1): 138-145.

[15] 王寿芹,赵永钦,刘莉莎,等.藏红花愈伤组织的诱导及植株再生[J].西南农业学报，2011,24(1):369-372.

[16] RAJA W, ZAFER G, WANI S A, In vitro microcorm formation in saffron (Crocus sativus L.) [J]. Acta Hortic, 2007,739:291-293.

[17] 卜学贤,陈维伦.活性炭对培养基中植物生长调节物质的吸附作用[J].植物生理学报,1988,14(4):401-405.

(责任编辑邹永红)

Study on Tissue Culture Conditions of Saffron Corm

LI Tao1,2， LI Chun-bin1， FAN Sheng-di1

(1.Key Laboratory of Biological Chemistry Engineering -The State Ethnic Affairs Commission - Ministry of Education, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China;2.Wuhan Company Ltd, Waterstone Pharmaceuticals Group, Wuhan Hubei 430070, China)

Abstract:A rapid propagation system of saffron (Crocus sativus L.) was established here using corms of saffron as explants by means of plant tissue culture. When the corms of saffron were cultured in the dark on MS medium containing 0.5 mg/L 6-benzyladenine (6-BA) and 4.0 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) for 20 days, the callus induction rate was as high as 96.7%. When the corms of saffron were cultured in the dark on MS medium containing 2.0 mg/L 6-benzyladenine (6-BA) and 0.5 mg/L naphthalene acetic acid (NAA) for 20 days, the callus induction rate was as high as 96%. When the corms of saffron were cultured in 1500 ～ 2000 lx lighting condition on MS medium containing 5.0 mg/L 6-benzyladenine (6-BA), 1.5 mg/L naphthalene acetic acid (NAA) and 0.3 g/L activated carbon (AC) for about 30 days, the cormels induction rate was as high as 90%.

Key words:Saffron; tissue culture; callus; cormlets

收稿日期：2016-03-18；最后修回日期：2016-03-26

基金项目：国家自然科学基金项目(21372037)。

作者简介：李涛(1989-)，男，湖北天门人，大连民族大学硕士研究生，主要从事天然产物与药物制造技术研究。通讯作者：李春斌(1973-)，男，黑龙江庆安人，副教授，博士，主要从事药用植物组织培养与天然产物研究，Email:lcb@dlnu.edu.cn。

文章编号：2096-1383(2016)03-0212-05

中图分类号：S567.219

文献标志码：A