育成品种易捕鲤F5代保种群体的遗传结构研究

赵新春，贾智英，李盛文，李池陶，石连玉，2

(1 中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070 ；2 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)



育成品种易捕鲤F5代保种群体的遗传结构研究

赵新春1,2，贾智英1，李盛文1,2，李池陶1，石连玉1，2

(1 中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070 ；2 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

[摘要]【目的】 研究易捕鲤的群体遗传结构，为其优良性状的稳定保持和种质资源的可持续利用奠定基础。【方法】 提取96尾易捕鲤个体的鳍条基因组DNA，以其为模板，利用30对微卫星标记进行PCR扩增，根据基因型，利用生物信息学软件对各种遗传参数进行分析。【结果】 在96尾易捕鲤个体中，共检测到154个等位基因，每个位点的等位基因数3～9个，平均有效等位基因数为4.060 7；期望杂合度为0.596 9～0.871 0，平均为0.740 0；多态信息含量为0.628 0～0.855 0，平均为0.702 2，说明此品种具有较丰富的遗传多样性；哈迪-温伯格平衡检验结果表明，群体处于不平衡状态；群体平均固定系数为-0.041 0，说明该群体存在杂合子过剩现象，有较大的选择压力；瓶颈效应分析表明，群体经历了瓶颈效应；根据连锁不平衡方法计算有效群体大小为64.2。【结论】 易捕鲤具有较高的遗传异质性和较大的选育空间，但由于人工选择的作用，群体处于不平衡状态，对品种的长期发展极为不利，因而在接下来的工作中应该注重加强保种策略的研究，从而保持其丰富的遗传多样性和优良的经济性状。

[关键词]易捕鲤；微卫星；遗传结构；保种

鲤(CyprinuscarpioL.)作为主要淡水养殖鱼种之一，在全球的淡水养殖鱼类中占有较大的比重。由于鲤是底层鱼类，具有较强的逃网能力和较低的回捕率，因而其在一些湖泊、水库中较难捕获，从而导致捕获量较低。为了提高鲤的养殖产量，黑龙江水产研究所利用高起捕率的大头鲤(Cyprinuspellegrinipellegrini)、德国镜鲤(CyprinuscarpioL.mirror)和黑龙江野鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)3个品种作为亲本进行杂交，从而选育出一个高起捕率的鲤新品——易捕鲤。通过在池塘、水库、室内水族箱中对易捕鲤起捕率进行测定，结果表明，其两网起捕率平均可达到95%以上[1]。由此可见易捕鲤不仅可以在大水面进行养殖而且具有起捕率高的优良特性。为了全面深入地了解易捕鲤的种质特性，防止该品种优良性状退化，对该品种种质资源的管理显得极为重要。

微卫星标记一般由1～6 bp的核心序列重复串联而成，具有丰富的多态性和信息量，广泛地应用于育成品种遗传结构的研究中，可为选育品种种质资源长期利用和管理提供支撑，如贾智英等[2]、石连玉等[3]利用微卫星标记对人工育成品种松浦鲤和松荷鲤保种群体遗传多样性和遗传结构进行研究，结果表明，松浦鲤和松荷鲤都具有较高的遗传多样性，2个育成品种虽然都经历了多代的人工选择，但其遗传多样性仍处于中上等水平，为二者的群体遗传研究奠定了坚实的基础。为了促进易捕鲤优良性状的稳定保存和种质资源的可持续利用，本试验用30对多态性较高的微卫星标记对易捕鲤保种群体的遗传多样性和遗传结构进行分析，以期为易捕鲤种质资源的有效保存和长期监测提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

易捕鲤(F5代)96尾，养殖于中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验站，编号1-1～1-96，取每尾鱼的鳍条置于体积分数75%的酒精之中，于-20 ℃的冰箱中保存。

本试验所用的主要试剂有琼脂糖、聚丙烯、硝酸银、氢氧化钠甲醇溶液、磁珠法组织DNA提取试剂盒(广州欣研技术有限公司，产品号(MD5112-03)、2×Es Tag Master Mix(康为世纪生物公司，产品号CW0690) 以及灭菌双蒸馏水。本试验所用主要仪器有磁珠法组织DNA提取仪、微量紫外分光光度仪、PCR仪以及琼脂糖凝胶和聚丙烯凝胶电泳仪等。

1.2方法

1.2.1DNA提取和引物的选取采用磁珠法提取易捕鲤鳍条DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其纯度和浓度后，稀释成50 ng/μL的溶液备用。微卫星引物参见文献[4-6]，具体引物信息见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表 1　30 对微卫星的信息

续表 1　Continued table 1

1.2.2PCR扩增PCR反应体系为25 μL：模板DNA (50 ng/μL)0.6～1 μL，2×Es Tag Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各1 μL，用灭菌双蒸馏水补足体积。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，最适温度退火30 s，72 ℃延伸30 s，23～26个循环；72 ℃总延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3电泳及染色PCR 产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电泳结束，用硝酸银染色后，拍照记录电泳结果。

1.2.4数据分析利用PopGene(Version 3.2)[7]软件分别对观测等位基因数(Observed number of alleles，A)、有效等位基因数(Effective number of alleles，Ae)、等位基因频率(Allele frequency)、观测杂合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity，He)、连锁不平衡等遗传变异参数进行统计。使用Genepop version 4.0软件的Markov chain法进行Hardy-Weinberg平衡检验[8](哈迪-温伯格平衡检验概率结果用P表示)，并对偏离平衡位点进行杂合过度与缺失分析，计算固定系数(FIS)。应用NeEstimator version 1.3软件根据基因型连锁不平衡原理进行有效群体大小估算[9]。应用kingroup v2软件计算全同胞率和半同胞率[10]。应用Bottleneck version 1.2.02 软件，基于无限等位基因模型(IAM)、双突变模型(TPM) 和逐步突变模型(SMM)的假设，分析标记检验(Sigh test)和Wilcoxon 标记秩检验(Wilcoxon sigh-rank test)结果的瓶颈效应[11]。应用phylip软件计算个体间遗传距离[12]，用MEGA 4.0软件构建个体聚类图[13]。

2结果与分析

2.1易捕鲤的微卫星扩增结果和遗传多样性

试验选取的30对微卫星标记在易捕鲤群体中均扩增出了具有特异性的清晰条带，图1为位点HLJ3410和HLJ3857的部分扩增结果。

图 1位点HLJ3410(A)和HLJ3857(B)对易捕鲤的部分扩增结果

Fig.1Yibu carp partial amplified results of HLJ3410(A) and HLJ3857(B)

易捕鲤群体的遗传变异参数见表2。由表2可知，所有微卫星座位共检测到154个等位基因，平均等位基因数为5.133个，单个标记检测到的等位基因数为3～9个；有效等位基因数为2.461 5～7.486 6，平均为4.060 7；观测杂合度为0.260 4～0.927 1，平均为0.703 5；期望杂合度为0.596 9～0.871 0，平均为0.740 0；多态信息含量为0.628 0～0.855 0，平均为0.702 2；本试验所选取的所有位点都具有高度多态性(P≥0.5)。易捕鲤的等位基因频率分布属于非“L”形(图2)。

表 2　30对微卫星遗传标记基因位点对易捕鲤的检测结果

注：P>0.05，位点处于Hardy-Weinberg平衡状态；P<0.05，位点处于不平衡状态；P<0.01，位点处于极不平衡状态。

Note：P>0.05,sites in Hardy-Weinberg equilibrium;P<0.05,sites in an unbalanced state;P<0.01,sites in a very unbalanced state.

图 2　易捕鲤的等位基因频率分布

2.2易捕鲤的Hardy-Weinberg 平衡检验和FIS值

表2表明，有7个位点处于Hardy-Weinberg 平衡状态，23个位点处于不平衡状态(P≤0.05)，其中有17个位点处于极平衡状态(P≤0.01)；易捕鲤群体内固定系数平均为-0.041 0。

2.3易捕鲤有效群体大小和同胞家系的检测

据遗传连锁不平衡得到的有效群体大小为64.2(CI95%=59.5～69.5)。用kingoup V2软件中的SDR方法检测易捕鲤群体的同胞率，结果表明易捕鲤群体中共检测到20个全同胞家系和26个半同胞家系，全同胞率和半同胞率分别为41.67%和54.16%，96尾易捕鲤群体的同胞家系(全同胞与半同胞之和)含有86个个体，同胞率为89.58%。

2.4易捕鲤的瓶颈效应分析

基于 IAM、TPM 和 SMM 假设的标记检验和 Wilcoxon 标记秩检验的总体结果见表3。由表3可知，易捕鲤在IAM、TPM假设下极显著偏离突变-漂移模型(P<0.000 1)，极显著的杂合过剩，在SMM假设的Wilcoxon 标记秩检验下极显著偏离突变-漂移模型(P<0.000 1)。从微卫星位点(表4)上来看，在 IAM假设下，25个位点偏离突变-漂移平衡(P<0.05)，其中18个位点极显著偏离(P<0.01) ；在 TPM 假设下，23个位点偏离突变-漂移平衡(P<0.05)，其中 12个位点极显著偏离(P<0.01) ；在 SMM 假设下，14个位点偏离突变-漂移平衡(P<0.05)，其中 5个位点极显著偏离(P<0.01)。因此，从微卫星变异来看，该品种部分位点偏离突变-漂移平衡，说明群体经历了瓶颈效应。

表 3　不同检验方法对易捕鲤品种突变-漂移平衡的分析结果

注(Note):**.P<0.01。

表 4　易捕鲤30个微卫星位点的瓶颈效应分析

注:Heq．平均期望杂合度;P．概率。

Note:Heq．Expected heterozygosity;P.probability．

2.5易捕鲤个体间遗传距离和个体聚类分析

由表5可知，易捕鲤个体之间遗传距离(D)为0.2～0.8，平均值为0.572 6，主要分布于0.4～0.7，约占94%。由图3可知,96尾易捕鲤个体形成2个分支，其中个体1-6、1-84～1-96号在一个分支上，其他个体在另一个分支上。

表 5　易捕鲤个体间遗传距离分布

图 3　易捕鲤个体的UPGMA聚类

3讨论

3.1易捕鲤的遗传多样性分析

遗传多样性不仅是种质评价的重要指标，同时也是生物多样性的核心。对于一个物种而言，丰富的遗传多样性可增强其对环境的适应能力和生存能力，反之则可能导致其生存能力和适应能力降低，最终导致物种退化[14]。对于人工选育品种而言，在选育过程中极易出现近交和遗传漂变，因而对选育群体的遗传多样性进行评估具有重要意义。有效等位基因数、期望杂合度以及多态信息含量是反映群体遗传多样性的重要指标，其值越高，表明该群体的遗传多样性越高；反之，说明群体的遗传一致性越高[15]。本试验结果表明，易捕鲤F5代平均有效等位基因数为4.060 7，平均期望杂合度为0.740 0，多态信息含量0.702 2，与池喜峰等[16]对易捕鲤F1-F4代的研究结果比较得出：随着易捕鲤选育世代的增加，其平均有效等位基因数逐代降低，从F1到F5易捕鲤平均有效等位基因数从7.761 9下降到4.060 7。赵广泰等[17]对大黄鱼连续4代选育群体的研究表明，随着选育的进行，F1到F4平均等位基因数从5.462下降到4.308。郑荷子等[18]对翘嘴鳜连续4代选育群体遗传多样性及遗传结构的研究表明，F1到F4的平均等位基因数从5.14下降到 2.57。这说明，对于人工选育品种而言，连续多代的选育所面临的人工压力和环境压力势必使其遗传参数发生变化，并且随着选育世代的增加，群体遗传多样性有下降的趋势，表明人工选择压力对其遗传多样性造成了影响。因此在后续的选育过程中，必须要完善选育措施，增加繁育亲本的数量，避免近交的影响。本试验多态信息含量和观测杂合度结果显示，易捕鲤虽然经过连续5代的选育，但其多态信息含量和期望杂合度并没有随着选育世代的增加而逐代下降，与目前报道的人工育成品种相比，易捕鲤的Ae和He与松浦鲤[2]相近，高于松浦红镜鲤[19]，低于松荷鲤[3]和建鲤[20],说明与其他人工选育品种相比，易捕鲤保种群体具有较高的遗传多样性水平，选育空间较大。

3.2易捕鲤的遗传结构分析

微卫星具有高度多态性和共显性孟德尔遗传的特点，因此用其对遗传结构进行研究结果更加精确，尤其是对小群体以及群体近期的变异，如瓶颈效应、哈代-温伯格平衡检验等的检测，效果尤为突出。

对于养殖群体而言，当种群有效数量急剧减少时，群体有效等位基因丢失，会导致群体经历瓶颈效应，近亲交配几率将大幅上升，从而导致种群遗传性能衰退[21]。因此瓶颈效对保种策略的制定具有重要的影响。贾智英等[2]的研究表明，松浦鲤等位基因频率分布于0.1～0.2的个体所占比例高于等位基因频率分布<0.1的个体，属于非“L”形，说明该品种经历了瓶颈效应。本研究易捕鲤等位基因频率分布也呈非“L”形，说明其也经历了瓶颈效应，这与在IAM、TPM和SMM模型下的假设检验结果相同。在目前已经报道的鲤鱼育成品种之中，松浦鲤[2]、松荷鲤[3]、松浦红镜鲤[19]等位基因频率分布都属于非“L”形，说明这些选育品种均经历了瓶颈效应。在本研究易捕鲤等位基因频率分布不仅属非“L”形，而且呈现出接近正态分布曲线的形状，说明易捕鲤群体显著地经历了瓶颈效应，出现此现象的原因可能是由于在选育的过程中所选取的亲本数量过少，未能剔除亲缘关系较近的个体，使得部分稀有等位基因丢失。所以在对易捕鲤的保种过程中，应该充分考虑其遗传背景，严格控制近亲繁殖，以保持群体丰富的遗传多样性。

在哈迪-温伯格平衡检验中，易捕鲤大部分(77%)位点处于不平衡状态。易捕鲤作为人工选育的品种，由于人工选择、近交、遗传漂变和亲本数量受限等因素的影响，导致大部分位点显著偏离哈迪-温伯格平衡，这与其他学者研究得出的人工选育品种大部分位点(高于50%)偏离哈迪-温伯格平衡的结论[2,22]是一致的。比较本试验结果与迟喜峰等[16]对易捕鲤F1-F4的研究结果发现，显著偏离平衡的位点由F1的7个上升到本研究F5的23个，这表明易捕鲤经过人工定向5代的选育，群体遗传结构发生了变化，随选育代数的增加，群体基因频率的变化加剧，使一些低频等位基因丢失。本试验易捕鲤平均FIS<0，表明该群体存在杂合子过剩现象，这可能是由于人工选择压力所造成的。从本研究结果看，易捕鲤保种群体遗传结构极不平衡，因而应当制定适宜的保种策略，保持该品种的遗传性能。

对于保种群体的研究，主要分析的参数是个体的遗传距离和个体聚类，根据遗传距离和聚类图分析结果，在后续的保种和繁殖工作中去掉亲缘关系较近的个体，以降低其遗传相似性。Barker[23]认为，遗传距离可以作为决策保种计划时研究群体结构的重要指标。遗传结构不仅是研究群体遗传多样性的基础，而且可以用来描述群体的系统分化。目前对于人工选育品种而言，松浦鲤[2]的遗传距离主要分布在0.5～0.8，松浦红镜鲤[19]和松荷鲤[3]的遗传距离主要分布0.4～0.6，本试验易捕鲤的遗传距离主要分布在0.4～0.7。一般认为群体分化的时间越短，遗传距离越小，从以上的研究结果来看，目前对于人工选育的鲤鱼品种而言，其遗传距离处于中等水平，群体分化时间较长;另外对易捕鲤同胞率的计算结果显示,其同胞率为89.58%，说明群体内有较高的近交压力。这提示在接下来的选育过程中，应尽量选择个体间遗传距离较大的个体进行配组，从而最大限度地避免近亲交配，以保持群体丰富的遗传多样性。

3.3易捕鲤的有效群体分析

有效群体分析是种质资源保存研究中不可或缺的内容[24-25]，保持足够大小的群体既可以降低近交几率，又可以保持群体的遗传多样性。本试验采用England等[26]研究的连锁不平衡方法对易捕鲤有效群体大小进行评估，结果显示其有效群体大小为64.2尾，本研究所采集样本尾数为96尾，满足连锁不平衡分析的样本数量，估算的有效群体大小能够准确说明该品种的有效群体数量。Nei等[27]研究表明，群体数量为有效群体的4～10倍时才能保持群体遗传多样性的稳定性，因此保持易捕鲤种质稳定的群体数量是256.8～642尾，在该范围内数量越大越有利于种质稳定保存。

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Genetic diversity of conservation population in Yibu F5common carp

ZHAO Xin-chun1,2,JIA Zhi-ying1,LI Sheng-wen1,2,LI Chi-tao1,SHI Lian-yu1，2

(1HeilongjiangRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin,Heilongjiang150070,China;2CollegeofFisheriesandLife,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract:【Objective】 Yibu common carp is a new breeding variety.In order to maintain the genetic diversity,its genetic structure was studied．【Method】 The sequences of 30 microsatellite loci were amplified by PCR using genetic DNA of 96 Yibu common carps as templates.According to the genotype,biological software was used for analysis of genetic diversity. 【Result】 From the 96 sampled individuals,154 alleles were detected with 3-9 alleles at each locus and the average number of 4.060 7.The expected heterozygosity was 0.596 9-0.871 0 with the average of 0.740 0.The polymorphic information content (PIC) was 0.628 0-0.855 0 with the average of 0.702 2.The results indicated rich polymorphism information content and large genetic diversity in the population.Hardy-weinberg equilibrium analysis showed that the population was in disequilibrium mode,indicating the artificial selection had a great effect on population.The average fixation index (FIS) was -0.041 0,showing that heterozygote excess existed in the population.Bottleneck analysis illustrated that the population had experienced bottleneck effect recently.The effective population size was 64.2 based on linkage disequilibrium method.【Conclusion】 Yibu common carp had rich genetic diversity,but the population structure was disequilibrium and bottleneck effect happened.Therefore,it is necessary to strengthen protection measure to maintain its rich diversity and economic traits.

Key words:Yibu common carp;microsatellite markers;genetic structure;reservation

DOI：网络出版时间:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.005

[收稿日期]2014-07-16

[基金项目]国家“十二五”科技支撑计划项目“重要水产种质资源群体构建及遗传评价方法研究”(2012BAD26B01)；国家大宗淡水鱼类产业技术体系北方鲤鱼种质资源与育种项目(CARS-46-02)

[作者简介]赵新春(1988-)，女，内蒙古赤峰人，在读硕士，主要从事水产遗传育研究。E-mail：zhaoxc0716@163.com[通信作者]石连玉(1960-)，男，辽宁西丰人，研究员，硕士生导师，主要从事水产遗传育种研究。E-mail:sly2552@aliyun.com

[中图分类号]S917；Q959.46+8

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)03-0028-09