环孢素A造成免疫功能低下小鼠模型的研究进展①

2016-06-15兰太进莫明月

中国免疫学杂志 2016年5期

关键词：环孢素动物模型造模

兰太进　莫明月　林　江

(广西中医药大学基础医学院，南宁530001)

环孢素A造成免疫功能低下小鼠模型的研究进展①

兰太进莫明月林江②

(广西中医药大学基础医学院，南宁530001)

免疫系统是机体的重要组成部分，对维持体内环境平衡和稳定发挥着重要作用。免疫功能低下是许多重大疾病共有的病理过程，为了研究药物对机体免疫功能的影响，常需要通过一定的方法建立免疫失衡动物模型。环孢素A(CsA)是一种新型的免疫抑制剂，它能选择性的抑制CD4+T细胞的生成，导致受试动物细胞免疫功能低下。本文主要通过对CsA造模方法及存在问题进行综述，以期为利用该模型进行相关实验或应用类试方法进行模型制造提供参考。

1CsA简介

CsA是上世纪70年代由山德士公司(Sandoz company)在进行无细胞毒性免疫抑制剂筛选的项目中被发现[1]。该药最早是从土壤中的丝状真菌(Tolypocladium inflatum)中分离得到[2]，其基本结构为11个氨基酸组成的环肽(详见图1)，分子量1202.6[3]。CsA作为一种新型的免疫抑制剂，在临床上常用于组织器官移植的抗排异反应，对CD4+T细胞具有选择性抑制作用[2]。深入研究发现，CsA主要通过阻止胞内活化信号的正常转导达到打破CD4+T细胞原有的自发增殖——凋亡动态平衡，已有的研究结果表明脂溶性的CsA进入胞内后，首先与环孢素结合蛋白(Cyclophilin，CyP)形成复合物(CsA/CyP)，然后CsA/CyP再与依赖钙/钙结合蛋白的钙调磷酸酶(Calcineurin，CaN)作用，抑制核因子激活T细胞(Nuclear factors of activated T cell，NF-ATc)的去磷酸化使其不能进入核内，抑制IL-2的产生[4]，从而抑制CD4+T细胞的生成[5]。

2CsA致免疫低下动物模型的制备及应用情况

依据CsA选择性抑制CD4+T细胞活性的特点，国内外学者尝试利用CsA建立细胞免疫低下动物模型并用于中草药免疫活性筛查及机制研究。由于CsA能抑制CD4+T细胞增殖，使CD4+T细胞数量降低，与艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染人体后引起的病理结果有相似性，一些学者又认为此模型亦可作为抗HIV辅助药物的筛选模型。

1999年，钱林发[6]首次将CsA用于T细胞免疫功能低下小鼠模型的制备，结果显示小鼠在肌肉注射(im)给予CsA[5 mg/(kg·d)，连续20 d]后胸腺总T细胞和辅助性T细胞(Th细胞，即CD4+T细胞)的数量均明显降低，而细胞毒性T细胞(CTL细胞，即CD8+T细胞)未降低，表明CsA可用于CD4+T细胞免疫抑制模型的制备，同时也表明该模型可用于药物的免疫活性筛选及机制研究。之后，湖南中医药大学葛金文研究团队提出将此种模型作为抗HIV辅助药物的研究模型，并对模型小鼠中枢免疫器官、外周免疫器官、T细胞亚群的病理改变进行了全面的考察，结果显示小鼠在腹腔注射(ip)给予CsA[15 mg/(kg·d)，隔天1次，连续3次]后表现出以CD4+T细胞减少为主要特征的免疫缺陷症状，类似HIV的致病特点[7]，说明该模型作为抗HIV辅助药物的筛选模型具有一定的可行性。

图1　CsA分子结构[3]Fig.1　Molecular structure of CsA[3]

有了前期动物模型制备条件及应用范围的考察，基于该模型的药物免疫活性筛选、药效机制研究及抗HIV辅助药物的筛选研究在这之后有了较多的报道。如采用ip给予小鼠CsA 30 mg/(kg·d)，连续7 d，建立免疫低下动物模型，观察药物康莱特注射液的免疫调节功能及可能的作用机制，结果表明受试药物具有提高机体免疫功能的作用，通过提高IL-2的表达以及调节NF-κB、IκBα蛋白水平是其可能的作用机制[8]。除ip给药外，也有采用灌胃(ig)给药的方式造成动物模型，如ig给予小鼠CsA 80mg/(kg·d)，隔天1次，连续3次建立免疫低下动物模型，观察牛磺鹅去氧胆酸的免疫增强机制，结果表明提高血清单核细胞和腹腔巨噬细胞内cAMP含量是其可能的作用机制[9]。除上述利用CsA致免疫低下模型进行药物免疫活性筛选及作用机制研究外，中国中医研究院王健团队还尝试利用该模型进行抗HIV辅助药物的筛选和作用机制研究[10]，研究采用ip给予小鼠CsA 25 mg/(kg·d)，隔天1次，连续3次建立模型，以外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞为主要指标，观察金龙胶囊抗HIV和提高HIV/AIDS患者免疫功能的作用机理，结果显示金龙胶囊能拮抗CsA诱导的免疫抑制作用，提示通过提高外周血CD4+T细胞比例达到抗HIV和提高HIV/AIDS患者免疫功能的作用是其可能的作用机制。

3讨论

从上述文献可以看出，CsA造模的给药途径有im、ip和ig，三种方式均能造成动物免疫功能低下。但从避免造模药物和治疗药物直接接触的角度出发，笔者认为宜采用im或者ip造模给药，因为ig给药影响因素较多，食物及其他药物都会影响CsA的吸收[11]，易致模型不均匀、不稳定，影响实验结果的判断。而选择im或者ip造模给药也存在缺点，易引起毒副反应，通过相关的药代动力学参数设置造模给药方案(剂量、间隔及时间)使小鼠血药浓度维持在一个有效安全的范围可以有效避免毒副反应的发生。CsA临床药动学参数已有大量的报道，而动物的研究相关报道很少。在进行动物实验研究时多参考临床报道参数，但是由于CsA主要是经肝药酶代谢失活[12]，而人与鼠的肝药酶代谢活性有着明显的不同，若将人的药物代谢参数平移到小鼠，结果很不准确。鼠CsA im或ip给药的药代动力学参数目前未明确，半衰期参数未知，有效血药浓度则不能确定，那么合理的小鼠造模给药方案就很难确定。而在利用药物造成动物模型时存在以下可能：药物给予剂量大或间隔时间短则可能造成模型损害过重，导致药效筛选结果假阴性，还可能出现严重的毒副反应；若是剂量较低及给药时间长可能造成模型不易复制成功，导致实验失败。因此有必要明确小鼠CsA im或ip药代动力学参数，分析CsA血药浓度与免疫功能低下的关系，找出一个合理的造模给药方案，以提高相关实验结果的准确性。正是由于CsA主要是经肝药酶代谢失活，所有对肝药酶有影响的药物及食物均会对CsA的代谢产生影响。在进行治疗药物干预的时候，需要考虑到治疗药物通过肝药酶间接影响CsA的代谢，从而影响药物的疗效甚至产生毒性。因此，有必要考察CsA代谢完全后，机体的免疫状态及其持续时间。相关实验宜优先考虑CsA在代谢完全后再给予治疗药物，否则需要进行药物相互作用的考察。

参考文献：

[1]Heusler K,Pletscher A.The controversial early history of cyclosporin[J].Swiss Med Wkly,2001,131(21-22):299-302.

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[3]Beauchesnep R,Chung NS,Wasan KM.Cyclosporine A:a review of current oral and intravenous delivery systems[J].Drug Dev Ind Pharm,2007,33(3):211-220.

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[8]吴岩，王彧杰，潘沛，等.康莱特注射液对免疫低下小鼠的免疫功能及NF-κB蛋白表达的影响[J].中医药导报,2012，18(01):12-14.

[9]刘明强，李培锋，毛伟，等.牛磺鹅去氧胆酸对小鼠机体cAMP和cGMP含量的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2012，5(9):138-140.

[10]徐淑玲，王笑红，张永祥，等.金龙胶囊对免疫受抑小鼠淋巴细胞亚群的影响[J].中国中医基础医学杂志,2005，11(12):908-909.

[11]Colombo D,Lunardon L,Bellia G.Cyclosporine and herbal supplement interactions[J].J Toxicol,2014,2014:145325.

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[收稿2015-09-25修回2015-10-16]

(编辑倪鹏)