TRC051384对小鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究*

陈豫贤，张秋芳

(1.南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管内科一病区，河南南阳 473058；2.湖北医药学院药理教研室，湖北十堰 442000)

TRC051384对小鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究*

陈豫贤1，张秋芳2

(1.南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管内科一病区，河南南阳 473058；2.湖北医药学院药理教研室，湖北十堰 442000)

[摘要]目的探讨HSP70的特异性诱导剂TRC051384对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法将88只C57BL/6小鼠分为4组：假手术组，单纯缺血再灌注损伤组(模型组)，缺血再灌注+TRC051384低剂量组(低剂量治疗组，10 mg/kg),缺血再灌注+TRC051384高剂量组(高剂量治疗组，40 mg/kg)。模型制作采用结扎左冠状动脉法，于结扎前10 min腹腔注射 TRC051384，缺血再灌注120 min后取标本，Western blot检测IκB、p65和cleaved-caspase-3蛋白的表达；ELISA法检测心肌组织中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，Evans蓝和TTC法检测心肌缺血和心肌梗死面积。结果与横型组相比，高剂量治疗组小鼠心肌缺血再灌注损伤后的缺血和梗死面积明显减少，TRC051384治疗可以显著抑制IκB的降解和p65的核内转移(P<0.05)，降低 TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平(P<0.05)。结论TRC051384对心肌缺血再灌注损伤可以发挥保护作用，有可能应用于心肌缺血再灌注损伤患者的临床治疗。

[关键词]心肌再灌注损伤；TRC051384;病例对照研究

随着我国老龄化人口的加剧，人民生活水平不断提高，冠状动脉粥样硬化在我国的发病率呈现逐年增加的趋势，严重威胁患者的生命健康，同时给社会和家庭带来巨大的经济负担[1]。心肌梗死后的治疗主要有溶栓和介入治疗，心肌缺血再灌注损伤是治疗中出现的常见现象，是影响患者预后的重要因素[2]。尽管以往研究对心肌缺血再灌注损伤后的病理机制有一定了解[3-4]，但是目前临床上尚缺乏有效的防治措施，以往研究发现热休克蛋白(HSP70)在心肌缺血再灌注损伤中的表达上调可以发挥抗心肌损伤作用，TRC051384是新近研发出的HSP70的特异性诱导剂，已经证实在脑损伤中发挥神经保护作用[5]。本研究通过研究HSP70在心肌缺血再灌注损伤中的心肌保护作用，以期为临床上心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的思路和方法。

1材料与方法

1.1材料实验用C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；核蛋白和总蛋白提取液购自碧云天生物公司，Western blot检测试剂盒购自康维科技公司；p65、IκB、HSP70、cleaved-caspase-3、β-actin和H3抗体均购自美国Santa cruz公司；炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6检测试剂盒购自北京欣博盛生物公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑试剂购自美国Sigma公司；TRC051384购自美国Tocris公司。

1.2方法

1.2.1实验分组及小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制作将实验用小鼠分为以下组：假手术组；心肌缺血再灌注损伤组(模型组)；心肌缺血再灌注+TRC051384(低剂量治疗组，10 mg/kg)，心肌缺血再灌注+TRC051384(高剂量治疗组，40 mg/kg)，结扎左冠状动脉前降支30 min前通过腹腔注射TRC051384；心肌缺血再灌注损伤模型制作方法：使用苯巴比妥将小鼠麻醉后，行气管插管呼吸机辅助呼吸，呼吸频率为50次/min，潮气量20 mL/kg，同时采用皮下插入针电极描记心电图，于3、4肋间、胸骨左缘开胸，剪断肋骨后逐层剪破胸膜、心包膜，在左冠状动脉前降支起始部，用6-0针线穿过心肌浅层，将丝线穿入直径为11 μm的聚乙烯管中，稳定1 min后抽紧丝线，将聚乙烯管压向冠状动脉并与丝线一并夹住，阻断冠状动脉血流，造成心肌缺血30 min，然后放松丝线和聚乙烯管，恢复冠状动脉血流。建模成功判断标准：心电图QRS波群增高、增宽，ST段抬高，假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线，不结扎，其余步骤同模型组。

1.2.2心肌梗死及缺血面积测定心肌梗死及缺血面积的测定方法参照文献[6]：将1%的Evans蓝注入小鼠心腔中，心肌非缺血部位的心肌被染成蓝色，缺血区不着色，通过颜色差别用以区分不同部位的心肌，然后用生理盐水将心腔冲洗干净，游离出左心室，将剩余的血管、双侧心房及右心室部分去除，测量左心室质量，后将其置于-20 ℃冰箱中冰冻30 min，取出后将左心室切成厚度约2 mm的切片，分离蓝色区域与非蓝色区域。将非蓝色心肌置于1%的TTC中37 ℃孵育20 min后，非梗死区染色呈现深红色，梗死区却变为灰白色，区分出梗死区与缺血区之后，将分离出来的缺血区、梗死区的心肌分别称质量，心肌缺血区的面积=缺血区心肌质量/左心室质量，心肌梗死区面积用梗死区心肌质量/缺血区心肌质量。

1.2.3Western blot缺血再灌注损伤后120 min，将小鼠深麻醉后，快速打开胸腔、取心脏，取左心尖部组织迅速放入-80 ℃冰箱中保存备用，每只小鼠取50 mg心肌组织进行蛋白的裂解、提取及变性。电泳、转膜后，5%牛奶封闭室温下1 h，p65、IκB、HSP70、cleaved-caspase-3、β-actin和H3抗体稀释液4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜后，二抗稀释液室温下1 h，TBST洗膜，滴加显影液，显影，Image J软件进行定量分析。HSP70、cleaved-caspase-3、和IκB的灰度值与内参β-actin的灰度比值作为最终表达量，p65与H3的灰度比值作为p65的最终表达量。

1.2.4ELISA法TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的测定：缺血再灌注损伤后120 min，在心肌组织中加入蛋白裂解液，充分碾磨后使蛋白裂解，离心后取上清液、定量，ELISA操作步骤严格按照说明书进行。

2结果

2.1心肌缺血和心肌梗死面积比较本组研究中缺血再灌注损伤120 min前未出现死亡，假手术组小鼠心肌组织中未见心肌缺血及心肌梗死区，模型组小鼠的心肌中出现大面积的心肌缺血和心肌梗死(P<0.05)。与模型组比较，高剂量治疗组中小鼠的心肌梗死和心肌缺血面积明显减少(P<0.05)，低剂量治疗组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2TRC051384对心肌缺血再灌注损伤后HSP70表达的影响与假手术组相比，模型组小鼠心肌组织中的凋亡蛋白HSP70的表达量显著增加(P<0.05)，TRC051384明显增加HSP70蛋白的表达量且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1、表2。

表1　各组小鼠心肌缺血再灌注后心肌缺血

a:P<0.05,与假手术组比较；b:P<0.05,与模型组比较。

1：假手术组;2：模型组;3：低剂量治疗组;4：高剂量治疗组。

图1TRC051384对心肌缺血再灌注损伤后HSP70表达影响的Western blot检测结果

2.3TRC051384对 HSP70、IκB、cleaved-caspase-3和核内p65蛋白表达的影响与假手术组相比，模型组小鼠中心肌组织中cleaved-caspase-3及核内p65的表达量显著(P<0.05)，总蛋白中IκB的表达量显著降低 (P<0.05)；高剂量治疗组可以显著增加抑制IκB的降解(P<0.05)，降低核内p65的表达(P<0.05)，同时显著抑制凋亡关键执行蛋白cleaved-caspase-3的表达量(P<0.05)。见图2、3和表2。

1：假手术组;2：模型组;3：高剂量治疗组。

图2缺血再灌注心肌损伤组织中IκB、cleaved-caspase-3表达水平

1：假手术组;2：模型组;3：高剂量治疗组。

图3缺血再灌注心肌损伤组织中p65的表达水平

2.4TRC051384显著抑制炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达与假手术组相比，模型组小鼠心肌组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量显著增加(P<0.05)，高剂量治疗组可以显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量(P<0.05)。

表2　心肌组织中HSP70、IκB、cleaved-caspase-3和p65表达的水平分析

a:P<0.05,与假手术组比较，b:P<0.05,与模型组比较。

表3　心肌组织中炎性因子TNF-α、IL-1β

a:P<0.05,与假手术组比较；b:P<0.05,与模型组比较。

3讨论

HSP70是机体内重要的应激蛋白，在所有的热休克家族蛋白中表达量最高[7]，以往研究发现缺血再灌注的应激反应可以显著诱导心肌细胞中HSP70的表达，HSP70在维护细胞的正常结构与功能上发挥“分子伴侣”作用，它与新合成的、未折叠以及错误折叠或者发生聚集的蛋白质相结合发挥作用，不仅可以解离某些蛋白质，减少不溶性聚集物的危险性，同时还能促进变性蛋白的降解和清除，保持酶的动力学特征，以维护细胞的功能，促进心肌缺血再灌注损伤的修复[8]。此外，HSP70还可以主动释放至细胞外，在心肌缺血再灌注损伤的动物模型和临床心肌损伤的患者血清中均检测到HSP70的高表达[9-10]，并且其表达量与患者的病情严重程度密切相关[11]。以往研究证实，在心肌缺血再灌注损伤模型中诱导HSP70的表达可以发挥显著的心肌保护作用[10，12]，本研究结果表明TRC051384可以显著诱导HSP70的表达，并显著抑制心肌缺血和心肌损伤的面积，发挥显著的心肌保护作用。

在证实TRC051384可以在心肌缺血再灌注损伤中发心肌保护作用后，本文作者进一步进行了相关机制的探讨。以往研究证实在心肌缺血再灌注损伤中HSP70过表达可以显著抑制NF-κB的活性[13]，从而减少心肌细胞的损伤，发挥心肌保护作用[14]。NF-κB是炎性反应和凋亡的重要调节因子，在静息状态下，NF-κB的主要功能亚单位p65与IκB结合，抑制其核内转移，缺血再灌注损伤可以使IκB迅速发生降解，脱离IκB束缚的p65蛋白将从细胞质内转移到细胞核内，与特异性的序列结合，从而调节下游相关目的基因的表达[15-16]。本研究结果发现TRC051384可以显著增加缺血再灌注损伤导致的IκB的降解，同时抑制p65的核内转移。此外，NF-κB下游的靶蛋白炎性因子TNF-α和IL-1β的表达量也得到显著抑制，这与TRC051384在缺血再灌注损伤模型中发现的作用具有一致性，这可能是其发挥心肌保护作用的主要机制之一。此外，本研究结果发现TRC051384可以抑制凋亡执行蛋白cleaved-caspase-3的表达，这可能是其发挥心肌保护作用的另一个机制。

综上所述，HSP70 的诱导剂TRC051384可以发挥显著的心肌保护作用，其机制主要与通过抑制NF-κB的活性相关。本研究结果提示TRC051384具有治疗心肌缺血再灌注损伤的潜质，未来需要在临床Ⅰ期实验中去证实。

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Effect of TRC051384 on myocardial ischemia-reperfusion injury in the mouse*

ChenYuxian1,ZhangQiufang2

(1.FirstWardofCardiovascularInternalMedicine,theFirstHospitalAffilatedtoNanyangMedicalCollege,Nanyang,Henan473058,China;2.DepartmentofPharmacologyHubeiMedicineCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of TRC051384 on myocardial ischemia-reperfusion (MI/R ) injury,with the goal of finding a better therapeutic options for MI/R injury.MethodsTotally 88 C57BL/6 mice were randomly divided into four groups：Sham group (operation group),MI/R group (ischemia-reperfusion withoutany intervention)，MI/R + TRC051384 group (10 mg/kg),and MI/R + TRC051384 group (40 mg/kg).TRC051384 were intraperitoneally injected 10 minutes before transient occlusion of the left anterior descending artery,followed by 120 minutes of reperfusion.Infarct size was measured by using triphenyltetrazolium chloride staining and ewing′s blue staining.Expression of p65,cleaved-caspase-3 and IκB were determined by western blot,and cytokines expression including TNF-α,IL-1β and IL-6 were measured by ELISA.ResultsMice treated with high dose of TRC051384(40 mg/kg) developed significantly smaller infarcts when compared with MI/R group(P<0.05).TRC051384 significantly reduced the expression of TNF-α,IL-1β and IL-6(P<0.05),and inhibited IκB degeneration and nuclear p65 translocation(P<0.05).ConclusionTRC051384 in situ murine model significantly reduced MI/R injury and may have clinical use in the future.

[Key words]myocardial reperfusion injury;TRC051384;case-control studies

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.006

作者简介：陈豫贤(1978-)，主治医师，本科，主要从事心血管内科基础与临床研究。

[中图分类号]R541

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)02-0164-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-09-16)