15种水产动物致病菌生长特性及形态特征研究

2016-06-13徐佩艾克特周静文庹锐万晶

长江大学学报(自科版) 2016年9期

关键词：致病菌

徐佩，艾克特，周静文，庹锐，万晶

(长江大学动物科学学院，湖北荆州 434020)

杨代勤，许巧情

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434020；湖北淡水健康养殖协同创新中心，湖北武汉434070)

15种水产动物致病菌生长特性及形态特征研究

徐佩，艾克特，周静文，庹锐，万晶

(长江大学动物科学学院，湖北荆州 434020)

杨代勤，许巧情

(长江大学动物科学学院，湖北荆州434020；湖北淡水健康养殖协同创新中心，湖北武汉434070)

[摘要]采用平板培养及革兰氏染色镜检，对15种水产动物致病菌生长特性及形态特征进行了研究。结果表明，鮰爱德华氏菌只在TSA培养基上能正常生长，而且生长非常缓慢；腐败希瓦杆菌B16在shieh培养基上能正常生长；其余细菌均能在LB培养基上生长。这些致病菌在形态上可分为3类：一类为球状菌，包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌和溶壁微球菌；第二类为杆状菌，包括枯草杆菌、嗜水气单胞菌B11、鮰爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、肺炎克雷伯菌、腐败希瓦杆菌B16、变形假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌；第三类为弧状菌，包括副溶血弧菌和河流弧菌。

[关键词]致病菌；革兰氏染色；细菌形态

细菌性疾病是鱼类中最为常见而且危害较大的一类疾病。随着养殖事业的发展，养鱼规模不断扩大，以及密养、精养技术的推广，细菌性疾病也在不断地暴发流行。如嗜水气单胞菌能广泛引起淡水鱼类细菌性败血症( 溶血性腹水病)，还可引起鳖的红底板病、穿孔病、出血性肠道坏死症、疖疮病以及青蛙的红腿病等[1]；河流弧菌可使鲤科鱼类患出血性败血症[2]；荧光假单胞菌可使以草鱼为主的多种淡水鱼患赤皮病[3]；迟钝爱德华氏菌可使鳗鲡、罗非鱼等海淡水鱼患红疫病爱德华氏病，也能引起池养鳝鱼的“红病”和渠道鲇鱼的“气肿性腐烂病”[4]；鮰爱德华氏菌可使斑点叉尾鮰等患肠道败血症[5]；无乳链球菌可使多种鱼类患链球菌病[6]；副溶血弧菌会引起对虾的红体病[7]；肺炎克雷伯菌是白鲢鳃丝、鳃耙溃烂病的致病菌，且该菌为强毒株等[8]。这些致病菌严重影响渔业的发展，造成了巨大的经济损失。本研究对15种常见的水产动物致病菌的形态特征进行了染色镜检观察，探讨了其生长特性，以期为水产动物细菌性疾病的快速鉴定提供参考。

1材料与方法

1.1材料

无乳链球菌、溶壁微球菌和鮰爱德华氏菌3种细菌由中国科学院水生生物研究所李爱华研究员惠赠，迟钝爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、腐败希瓦杆菌B16、河流弧菌、嗜水气单胞菌B11、变形假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌等购自上海北诺生物科技有限公司。

1.2方法

将金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、溶壁微球菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血弧菌、河流弧菌、表皮葡萄球菌、嗜水气单胞菌B11、枯草杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、变形假单胞菌、荧光假单胞菌、鮰爱德华氏菌、腐败希瓦杆菌等细菌的菌株在无菌的环境中分别接种到LB、TSA、sheih琼脂平板上，在37℃或28℃的培养箱里培养12～24h，观察菌株的生长情况。

选取在37℃或28℃的培养箱里培养12～24h后具有隆起、光滑、湿润、圆形的菌落，用划线的方式接种于LB、shieh或TSA琼脂平板上，置 37℃或28℃的培养箱里培养18～24h，保存在4℃的环境中备用。将所培养的细菌分别挑取单克隆进行革兰氏染色后再镜检观察其形态特征。

2结果与分析

金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、溶壁微球菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌均能在LB培养基上正常生长。金黄色葡萄球菌的菌落呈现金黄色，圆形、光滑、湿润，针尖或米粒大；无乳链球菌在营养培养基上生长缓慢，菌落较小，均为白色圆形、表面润滑光滑、微隆起、边缘整齐；表皮葡萄球菌的菌落呈现淡黄色，圆形、光滑，有点浑浊；溶壁微球菌、枯草杆菌、肺炎克雷伯菌、变形假单胞菌、DE3、腐败希瓦杆菌的菌落圆形，表面光滑，微隆起(图1)。

图1　5种革兰氏阳性致病菌在培养基上的生长形态

在LB培养基上能正常生长的革兰氏阴性致病菌有肺炎克雷伯菌、河流弧菌、嗜水气单胞菌B11、迟钝爱德华氏菌、副溶血弧菌、变形假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌。

鮰爱德华氏菌最佳的培养基TSA培养基，腐败希瓦杆菌B16最佳的培养基为Shieh培养基。嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，形成边缘整齐、表面湿润、隆起、光滑、半透明、灰白色至淡黄色的圆形菌落；迟钝爱德华氏菌在普通营养琼脂上呈圆形光滑、较透明或半透明、边缘整齐、无色或浅灰白色、稍隆起、直径多在0.5mm(培养48h后多在1.2mm左右)；副溶血弧菌在浓度大的地方, 菌落边缘不齐, 出现锯齿状, 单个菌落圆形、隆起, 表面光滑湿润, 稍混浊不透明, 不产生色素；河流弧菌在LB 培养基平板上菌落呈圆形，表面光滑、湿润，边缘不规则，质地均匀，不透明，呈蜡样；荧光假单胞菌在普通琼脂培养基上生长，菌落圆形、边缘整齐、灰白色、半透明、湿润，菌落直径0.5～1.0mm，培养24h后开始产生绿色或黄绿色色素，弥漫培养基。大肠杆菌在营养琼脂培养基上培养菌株生长 24h 后，形成直径 2～3mm 边缘整齐的菌落，菌落圆形、光滑、湿润、半透明、灰白色、凸起；鮰爱德华氏菌是这些致病菌中较难培养的，在培养基平板上生长较缓慢，常需培养约48h才能形成直径1～2mm、圆形光滑、边缘整齐、稍隆起的无色小菌落(图2)。

图2　10种革兰氏阴性致病菌生长状态

由图3可看出，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、溶壁微球菌和枯草杆菌染色镜检时颜色为紫色，表明它们属革兰氏阳性菌。其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌和溶壁微球菌的细菌形态均为球状而枯草杆菌的形态为杆状。

图3　5种革兰氏阳性致病菌镜检形态

由图4可看出，嗜水气单胞菌B11、鮰爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、肺炎克雷伯菌、腐败希瓦杆菌B16、变形假单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和河流弧菌染色镜检时颜色为红色，表明它们属革兰氏阴性菌。其中嗜水气单胞菌B11、鮰爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、肺炎克雷伯菌、腐败希瓦杆菌B16、变形假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌的菌体两端钝圆,直形或略弯,革兰氏阴性短杆菌,单个或成双存在。而副溶血弧菌，河流弧菌革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，两极浓染，无荚膜，无芽孢，有鞭毛。

图4　10种革兰氏阴性致病菌镜检形态

3讨论

本研究对15种常见的水产动物致病菌进行平板培养和革兰氏染色镜检观察，对其生长特性和形态特征进行了研究，可为快速鉴定水产动物病原菌提供参考。朱芝秀等[9]从患病黄颡鱼体分离出菌株，采用PCR方法检测出致病性嗜水气单胞菌为其致病菌。谭晶晶等[10]采取菌体形态观察、生理生化鉴定及16S rRNA基因序列分析等方法从患病奥尼罗非鱼中分离病原菌进行鉴定，结果表明，引发海南地区罗非鱼暴发性链球菌病的主要病原是无乳链球菌。张芹等[11]利用生理生化的方法鉴定斑点叉尾鮰的致病

菌株，结果表明鮰爱德华氏菌是其致病菌。徐芊等[12]利用LAMP方法快速地检测副溶血弧菌，结果表明该方法是检测副溶血弧菌的有效手段。唐毅等[13]利用细菌生化鉴定了肺炎克雷伯菌，回归感染试验结果与自然感染发病的症状一致, 初步证实肺炎克雷伯氏菌为白鲢鳃丝、鳃耙溃烂病的致病菌，且该菌为强毒株。与上述鉴定致病菌的方法相比，本研究所用方法具有操作简单、快速、成本低等特点，适用于广大养殖户对水产动物致病菌的快速识别，可为水产动物细菌性疾病诊断提供参考。

[参考文献]

[1]张运强,李庆乐.嗜水气单胞菌的致病性及其防治方法[J].广西农业科学,2007,38(5):565～568.

[2]黄玉柳,黄国秋,叶欣宇,等.文蛤中1株河流弧菌的分离·鉴定以及药敏试验[J]安徽农业科学,2012,40(9):5234～5242.

[3]邓显文,谢芝勋,刘加波，等.罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定[J].广西农业科学,2010,41(6):612～615.

[4]陈翠珍.爱德华氏菌及鱼类爱德华氏菌病(综述)[J].河北科技师范学院学报,2004,18(3):70～75.

[5]张芹,宋威,陈杰.斑点叉尾鮰鲇鱼爱德华氏菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学,2010,38(35):20121～20122.

[6]卢迈新,黎炯,叶星，等.广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析[J].微生物学通报,2010,37(5):766～774.

[7]蔺红苹,邱德全,谭龙艳.一株副溶血弧菌的分离和鉴定[J].水产科学,2007,26(5):296～299.

[8]唐毅,张芬,孙翰昌,等.白鲢肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J].西南大学学报,2007,29(6):74～76.

[9]朱芝秀,邓舜洲,杨竹青，等.致病性嗜水气单胞菌PCR快速检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2012,39(12):40～44.

[10]谭晶晶.奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定及免疫预防的初步研究[D].武汉：华中农业大学,2011.

[11]张芹,宋威,陈杰.斑点叉尾鮰鲇鱼爱德华氏菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学,2010,38(35):20121～20122.