猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

周景明，刘芳冰，祁艳华，张改平,2，栗 宁，王爱萍*

(1.郑州大学生命科学学院，河南郑州 450001；2.河南农业大学,河南郑州 450002)



猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

周景明1，刘芳冰1，祁艳华1，张改平1,2，栗 宁1，王爱萍1*

(1.郑州大学生命科学学院，河南郑州 450001；2.河南农业大学,河南郑州 450002)

摘要[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段，连接到真核表达载体pEGFP-C1上，构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒pEGFP-E0。通过双酶切鉴定，PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致，插入位置完全正确后，利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中，转染48 h后在荧光显微镜下观察，可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光，说明转染成功。通过G418筛选后，在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光，这表明重组融合蛋白pEGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆，为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词猪瘟病毒；E0蛋白；增强型绿色荧光蛋白；PK-15细胞

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性传染病，临床上以高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征[1]。世界动物卫生组织将其列为 A 类传染病，我国也将其列为一类传染病。猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus),为单股正链RNA病毒[2]，其基因组编码1个多聚蛋白，经宿主细胞和病毒蛋白酶裂解后产生4种结构蛋白(C(p14)、E0(gp44/48)、E1(gp33)和E2(gp55))和7种非结构蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[3]。CSFV 自然感染猪后，机体可产生针对结构蛋白E2、E0和非结构蛋白NS2-3的抗体[4]。

E0蛋白是CSFV的一个保护性抗原蛋白，可诱导产生中和抗体，其抗原性与 E2 相比是能诱导机体产生保护性免疫力的第二抗原蛋白。E0蛋白由病毒 ORF中 GLu168-ALa494 组成[5]，有 9 个可能的糖基化位点，糖基化前后的分子质量分别为 25.7 ku 和 44～48 ku[6]。E0是唯一一个可以分泌到猪瘟病毒感染的细胞培养液上清中的糖蛋白[7]。Shen等[8]研究表明 E0可单独诱导免疫保护，诱导产生的中和抗体可以抵抗大剂量猪瘟病毒的攻击。利用在昆虫细胞表达的 E0和 E2进行的抑制试验表明，E0和 E2 是与不同的细胞表面受体作用，猪瘟病毒最初是通过E0的介导才能结合到细胞上的[9]。另外，在各毒株内编码 E0的氨基酸序列比编码 E2 的氨基酸序列要更加保守[10]。因此，E0是防治猪瘟的主要靶蛋白之一。笔者利用猪源性的PK-15细胞作为表达猪瘟病毒E0糖蛋白的表达系统，将猪瘟病毒E0基因在PK-15细胞中进行表达，并进行双酶切鉴定，旨在为E0病毒的基因工程疫苗的实际生产和应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与质粒。PK-15细胞来自河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室；真核表达载体pEGFP-C1购自北京天恩泽公司，含有目的基因E0片段的pET28a-E0(BL21)菌种由郑州大学分子免疫学实验室保存。

1.1.2工具酶及试剂。质粒DNA纯化试剂盒，为TaKaRa公司产品；Lipofecta mine 2000试剂盒为invitrogen公司产品；胎牛血清和DMEM培养基，购自Gibco公司；使用的培养基为DMEM(含10%胎牛血清、链霉素、青霉素)完全培养基，加入NaHCO3调节pH至7.0 。限制性内切酶Xho1和Kpn1以及T4连接酶，均购自TaKaRa公司。

1.1.3仪器。TP-214分析天平，为美国Denver公司产品； mini-PROTEAN Tetra System电泳仪、GeL DocTMXR+ 凝胶成像系统，为美国Bio-Rad公司产品；NanoDrop 2000c分光光度计、Barnstead Nanopure超纯水仪，为美国Thermo公司产品；CMAG HS4加热磁力搅拌器，为德国IKA公司产品；H1650-W台式高速离心机，为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；WD-9405B型水平摇床，为北京市六一仪器厂产品；透析袋MD25，为北京索莱宝科技有限公司产品；IX71倒置式荧光显微镜，为日本OLYMPUS公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计。根据GenBank数据库中公开发表的猪瘟病毒E0序列，利用Primer Premier 5.0设计引物扩增E0序列，预计扩增片段681 bp，设计其上下游引物：上游引物F为5′A CTCGAGCTGAAAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAACG 3′的5′端含有Xho1酶切位点，下游引物R为5′A GGTACCGGCATAAGCGCCAAACCAGGTTTT 3′的5′端含有Kpn1酶切位点。

1.2.2载体构建。以提取的pET28a-E0基因组DNA为模板，以F/R为引物，扩增E0基因，向50 μL体系中加入ExTaq酶25 μL、引物各0.5 μL、模板1 μL，然后加超轻水补足50 μL，PCR程序为：95 ℃变性5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃延伸7 min。

1.2.3重组质粒的构建。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物,并用DNA纯化回收试剂盒回收纯化681 bp的E0 基因片段,将回收片段进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带是否正确。以Xho1和Kpn1 2个限制性内切酶同时对载体和E0片段进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳电泳并用DNA纯化回收试剂盒回收，用T4连接酶进行连接反应，连接条件为4 ℃过夜，将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，在含Amp的LB培养基平板上挑取阳性单克隆，对质粒分别进行PCR鉴定、双酶切鉴定，鉴定成功后送交公司测序。并将成功构建的重组质粒命名为pEGFP-E0。

1.2.4PK-15细胞的转染。用质粒DNA纯化试剂盒纯化pEGFP-E0质粒后供转染用。细胞重悬以后，进行细胞计数，根据12孔板底面积大小，每孔铺5×105个，铺4孔，添加DMEM完全培养基补至3 mL，过夜培养至细胞密度90%以上，DMEM不完全培养基冲洗每孔。最后，每孔加入2 mL DMEM，准备转染液，A液为240 μL DMEM﹢10 μL脂质体2000，B液为230 μL DMEM﹢20 μL(4 μg)质粒，将A液混匀后室温放置5 min后，再将A液、B液混匀，室温放置20 min。将转染液逐滴加入试验孔中，轻摇。

1.2.5G418筛选。转染6 h后观察并记录荧光情况，并将转染培养基更换为完全培养基，转染48 h后更换为G418筛选培养基，通过预试验确定G418筛选浓度为600 μg/mL。每3～5 d更换1次筛选培养基，以除去死亡细胞和细胞碎片。约21 d后在荧光倒置显微镜下观察细胞的荧光情况。

2结果与分析

2.1载体构建PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在681 bp左右的位置出现特异性片段，与预期结果一致。将此片段与真核表达载体pEGFP-C1进行双酶切与连接(图1)，获得了重组质粒pEGFP-E0。经Xho1和Kpn1双酶切，可获得681 bp左右的特异性片段(图2)；以pEGFP-E0为模板，以F/R为引物，可扩增出681 bp大小的片段(图3)。重组质粒经测序鉴定，无氨基酸突变和碱基突变，表明重组载体构建成功。

注：M1.DL2 000 Marker; 1.E0基因的双酶切产物；2.载体pEGFP-C1双酶切产物；M2.DL 15 000 Marker.Note:M1.DL2 000 Marker; 1.Double enzyme digestion of E0 gene; 2.Double enzyme digestion of vector pEGFP-C1; M2.DL 15 000 Marker.图1　将载体pEGFP-C1和质粒E0同时进行双酶切与连接Fig.1　The double enzyme digestion and connection of pEGFP C1 and E0 plasmid

注： M.DL2000 Marker; 1.重组质粒的双酶切产物。Note:M.DL2000 Marker; 1.Double enzyme digestion of recombinant plasmid.图2　重组质粒pEGFP-E0的双酶切鉴定Fig.2　Double digestion of recombinant plasmid pEGFP - E0

注： M.DL2000 Marker; 1.重组质粒的PCR产物。Note:M.DL2000 Marker; 1.PCR products of recombinant plasmid.图3　重组质粒pEGFP-E0的PCR鉴定Fig.3The PCR identification of recombinant plasmid pEGFP-E0

图4　转染6 h后观察到的荧光现象(A)、转染过程的荧光现象(B)和最终筛选出来稳定转染上重组质粒的PK-15细胞(C)Fig.4　The fluorescence phenomenon after transfection 6 h(A)，fluorescence phenomenon in the process of transfection(B)，final filtered PK 15 cells stable transfected with recombinant plasmid(C)

2.2E0基因表达产物的检测转染6 h后在荧光倒置显微镜下观察到大面积的荧光，后期G418筛选过程中荧光数量在逐步减少，约14 d后对照组细胞全部死亡，约7 d后仍有约10%的细胞有荧光，由此获得了稳定整合有外源基因的PK-15细胞克隆(图4)。

3讨论

目前应用于蛋白表达的系统大多为原核表达系统(如大肠杆菌类表达系统)，大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟，但其表达产物以包涵体形式存在，因为缺乏蛋白质加工系统，所以无翻译后的加工修饰过程，其内源性蛋白酶易降解表达的蛋白质分子且细胞膜间隙含有大量的内毒素。后来，真核表达系统是最具发展前景的蛋白质产生方式，目前研究较多的是酵母和昆虫细胞表达。酵母和昆虫细胞表达存在不正确糖基化，并且还有产物复杂不易纯化、表达量较低、病毒污染等问题。据报道，单个细胞表达蛋白量达20 pg/d的工程细胞株[11],分批补料式生物反应器悬浮培养细胞密度达2 000万/mL以上,蛋白产量高达10 g/L[12-13]。 利用猪源性的PK-15细胞作为表达猪瘟病毒E0糖蛋白的表达系统，一方面是为了提高E0蛋白的表达产量，因为PK-15细胞对猪瘟病毒的遗传密码子具有嗜好性。另一方面，该系统对E0蛋白的后期加工可以使得该蛋白的反应原性和免疫原性得到很大提高，为将该病毒的基因工程疫苗投入实际生产和应用奠定了基础。

重组质粒pEGFP-E0稳定转染PK-15细胞系时，只有部分质粒能够通过细胞质的阻碍进入到细胞核内，而最多只有80%进入细胞核内的外源DNA能够得到瞬时表达。只有极少数进入细胞的外援基因在通过一系列非同源分子间重组和连接后整合到细胞染色体中，细胞基因组的自由部分进行表达。此外，在此整合的过程中，并不一定所有整合到细胞染色体的外源基因都能够表达，因为整合的区段是不同的。只有整合到了表达区段的基因才能够表达，所以要筛选出能够稳定表达外源基因的转染体，筛选的依据为共转染的编码抗生素的抗性基因所提供的新表型。

G418是稳定转染常用的筛选试剂，它是一种氨基糖类抗生素，其结构与庆大霉素、新霉素、卡那霉素相似，它能够阻断蛋白质的合成，因此对原核和真核细胞都具有不同的毒性 ,其中包括细菌、植物、酵母、哺乳动物细胞以及一些原生动物和蠕虫。但是，当pEGFP-C1载体所携带的neo抗性基因被整合到细胞基因组正确的位置后，它能够启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而使得neo抗性产物——氨基糖苷磷酸转移酶高效表达，进而将G418转变成无毒形式，使得细胞获得足够的抗性，并且能够在含有G418的筛选培养基中生长。连续使用筛选培养基筛选14～21 d,在此过程中要及时更换培养基，去除死亡细胞的细胞碎片，以免死细胞产生的有害物质影响正常细胞的生长。约21 d后，就能够得到稳定表达外源基因的细胞克隆，将此克隆用胰酶消化至培养板中继续传代培养，并收集表达的重组蛋白。

由于PK-15细胞本身没有绿色荧光蛋白基因,将PEGFP和猪瘟病毒E0基因的编码区相连得到的重组基因可以用来研究基因的表达情况和活细胞内外源基因表达蛋白质的定位。笔者成功地表达了PEGFP-E0融合蛋白,为进一步大量表达和纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。

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Expression and Identification of E0 Protein of Classical Swine Fever Virus in PK-15

ZHOU Jing- ming，LIU Fang-bing，QI Yan-hua，WANG Ai-ping*et al

(School of Life Science，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001)

Abstract[Objective] The aim was to study the characteristic how gene E0 of classical swine fever virus (CSFV) expressed in PK-15.[Method] E0 gene whose full length was 681 bp fragment was cloned by PCR，and then a recombinant plasmid was constructed with eukaryotic expression vector of pEGFP-C1，double enzyme digestion was conducted.[Result] A recombinant plasmid pEGFP-E0 was sucessfully constructed，by restriction enzyme digestion，PCR identification and sequencing，the size of the target gene and insertion position was determined and was right，then recombinant plasmid were transformed into pig kidney-derived cells PK-15 by the Lipofecta mine 2000 transfection kit，after transfection 48h，many cells showed green fluorescence under a fluorescence microscope，which indicated the transfection was successful.After screening by geneticin，there were still green fluorescent cells under the fluorescence microscope，which indicated that the recombinant fusion protein of pEGFP-E0 was expressed in the cell PK-15.[Conclusion] The obtain of expressing recombinant fusion protein of cell clones lay a foundation for further mass production of soluble glycoprotein E0，preparing its monoclonal antibody epitope screening and researching the biological function of protein E0.

Key wordsCSFV; E0 protein; Enhanced green fluorescent protein; PK-15 cell

基金项目国家自然科学基金项目(31172331)。

作者简介周景明(1972- )，男，河南南阳人，副教授，博士，硕士生导师，从事分子免疫学和免疫学检测技术研究。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事分子免疫学研究。

收稿日期2016-03-11

中图分类号S 852.65+1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)10-160-03