必特螺旋霉素发酵组分中亮氨酸的影响研究

杜仙娥 付联群 李红梅

必特螺旋霉素发酵组分中亮氨酸的影响研究

杜仙娥 付联群 李红梅

目的 研究分析必特螺旋霉素发酵组分中亮氨酸的影响。方法 在合成培养基中加入亮氨酸，观察其对于必特螺旋霉素发酵组分的影响。结果 加入亮氨酸以后，对于初级代谢所产生的影响不大，可提高异戊酞基螺旋霉素组分以及总异戊酰基螺旋含量，效价保持不变。讨论 亮氨酸可使必特螺旋霉素主要组分作用机理得到提高。

亮氨酸；组分；效价；必特螺旋霉素

目前关于支链氨基酸代谢影响抗生素生物合成与相关酶方面的研究已非常多，曾有学者在avermectin生物合成研究中发现若突变菌株不含支链-2氧基脱氢酶活性，则不能在不含亮氨酸、缬氨酸以及异亮氨酸的合成培养基中正常生长[1]。经相关文献报道研究发现，氨基酸与脂肪酸类物质对于链霉菌酞化抗生素产生具有诱导以及促进作用[2-3]。

1 材料与方法

1.1 一般材料 所用菌株为含有异戊酞基转移酶基的整合型螺旋霉素链霉菌F21，根据要求配制斜面培养基、生物效应测定培养基、种子培养基以及发酵培养基。所用试剂有丁酸、乙酸、异戊酸、柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及丙酮酸，除α-酮戊二酸是生化试剂以外，其余均是分析纯试剂，所用仪器有FUS-15L发酵罐，该仪器不仅配备常规测量控制，如温度、DO、转速和消泡等，还配备高精度补料测控，比如基质、消泡剂以及酸碱等。

1.2 方法 采取PMV法对菌种浓度进行测定。将10mL发酵液放在离心机进行离心，时间为10min左右。根据中国药典采取杯碟法对生物效价进行测定，将乙酰螺旋霉素当作标准品，而鉴定菌则是枯草芽孢杆菌。采取HPLC法对有机酸以及氨基酸进行测定，主要如下：首先对样品进行处理，将必特螺旋霉素发酵液放在离心机进行离心，时间共为10min，取上清液放在-20℃储存备用。分析时取1mL，进行离心，而后用合成纤维素酯膜实施真空过滤。在测定有机酸时，α-酮戊二酸、乙酸、丙酮酸以及丙酸色谱柱为AquaSep，甲醇为98.4︰1.3，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液，流速为每分钟1mL，检测器波长为210nm，且柱温为30℃。测定异戊酸和丁酸时，色谱柱为Shimpack VP-ODS，甲醇为60︰40，流动相、流速条件均和乙酸等一致。在测定氨基酸时，所用色谱柱为AgilentDB-C18，柱温为38℃，流速为每分钟1mL，波长为254nm。借助于自动进样器进样，采取三相洗脱。

2 结果

把亮氨酸添加至必特螺旋霉素发酵中，对于必特螺旋霉素生物合成和菌体生长所产生的影响明显，生长期结束以后菌浓出现一定的波动，于48～72h内略微上升；发酵后期，因培养基中养分耗尽，且菌体自溶，此时菌浓降低。加入氨基酸以后，菌体于产素期生长以及维持受抑制，此时菌浓下降范围为1%～5%内。加入氨基酸后的24h内效价增长比较缓慢，加入亮氨酸后期生活效价与对照基本一样。见图1。加入亮氨酸后，必特螺旋霉素中异戊酸基螺旋霉素Ⅱ与Ⅲ明显上升，总异戊酸基螺旋霉素含量也有所提高，而螺旋霉素所占比重则明显降低。见表1。从该结果来看，亮氨酸可促进必特螺旋霉素中异戊酞螺旋霉素合成。加入亮氨酸后培养基PH和对照相比要高，发酵液中铵离子为3.5nmol/L，糖耗速率为0.3～0.5g/(L・h)。当加入亮氨酸时，柠檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶活性均发生显著改变，同时初级以及次级代谢所受影响不大，对此效价也未发生较大改变，但必特螺旋霉素中总异戊酞螺旋霉素组份含量却明显上升。见图2。必特螺旋霉素为短链脂肪酸单体通过聚酮合成酶头尾缩合而形成，而这些短链酯酸酶浓度对于其生物合成可产生较大影响。加入亮氨酸后，乙酸浓度未发生显著改变，胞外丙酸与对照大致一样，胞外异戊酸浓度显升高，于84h可达至166mmol/L，丁酸变化情况和对照基本一致，从该结果可知，加入亮氨酸对于丙酸以及乙酸的影响较小，效价变化小，而必特螺旋霉素中异戊酞基螺旋霉素组分所占比重明显上升，可见亮氨酸通过分解代谢后所产生的这种异戊酸基CoA能当作螺旋霉素4”侧链前体。

图1 添加亮氨酸至比特螺旋霉素发酵过程表示注：1表示对照,2表示亮氨酸

表1 亮氨酸对必特螺旋霉素组分的影响分析

图2 添加亮氨酸时柠檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶活性变化情况注：1表示48h,2表示60h

3 讨论

必特螺旋霉素属于大环内酯类抗生素，基于螺旋霉素，经4”-O异戊酞基转移催化，于4”位置上和一系列酞基相接入，以此形成为多组分酞化螺旋霉素，同时该抗生素目前已通过Ⅱ期临床研究，其组分中所含戊酞组分量对于其生物活性可产生较大影响[4-5]。经药效研究发现，必特螺旋霉素所具体外抗菌谱较广，毒性较低，其药效和乙酰螺旋霉素大致一样，于体内具有较好稳定性[6]。大环内酯类抗生素内酯环形成所需前体物质有乙酸、丁酸以及丙酸，上述这些物质均来自糖酵解途径、氨基酸代谢、三羧酸循环和脂肪酸，不管是在初级代谢，还是在次级代谢中所扮演的角色均非常重要[7-8]。本次研究就必特螺旋霉素发酵组分中亮氨酸的影响进行了研究分析，亮氨酸属于一种支链氨基酸，联合异亮氨酸、缬氨酸，可修复肌肉，可快速分解转化成为葡萄糖，有效控制血糖，提供相应的能量给身体组织。通过研究分析发现，加入亮氨酸对于必特螺旋霉素生物效价所产生的影响不是很显著，但可使异戊酸基螺旋霉素含量显著上升。加入亮氨酸以后，乙酸和丙酸未发生显著变化。同时本次研究还发现，当发酵进行至36h时加入亮氨酸，异戊酸基螺旋霉素组分所占比例明显上升，可见，亮氨酸通分解代谢后，所产生的这种异戊酸基Co A能被当作螺旋霉素4”侧链前体。此外，胞外异戊酸于48小时后积累于胞外，而后又在此被重新吸收至胞内。加入亮氨酸以后和对照相比，发酵前期和中期效价均略低，结束时略高，究其原因可能是因糖耗速率和EMP途径代谢通量相比，稍微下降，继而造成前期效价比对照稍微低一些，而在后期则因乙酸积累，可使大环合成前体物质得到补充，因此效价稍微上升。

综上所述，亮氨酸作为支链氨基酸，有利于必特螺旋霉素发酵中组分以及效价的优化。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.9.015

湖北 448000 荆门市第二人民医院 （杜仙娥 付联群 李红梅）