绿色荧光标记的骨髓基质细胞移植治疗脑损伤的实验研究

赵晓程， 郑春芳， 冯　云， 李海龙， 郝风玲， 麻晓融， 董宇峰

(包头医学院第二附属医院神经外科，内蒙古包头 014030)



绿色荧光标记的骨髓基质细胞移植治疗脑损伤的实验研究

赵晓程， 郑春芳， 冯云， 李海龙， 郝风玲， 麻晓融， 董宇峰

(包头医学院第二附属医院神经外科，内蒙古包头 014030)

[摘要]目的：探讨骨髓基质细胞移植在脑损伤后神经功能恢复中的作用及其机制。方法：制作大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)模型，将培养成功的骨髓基质细胞(bone marrow stroma cells，BMSCs)通过慢病毒转染至大鼠体内，进行放射形迷宫觅水实验。结果：(1)荧光显微镜下观察，移植后2周、4周、6周GFP-BMSCs切片中，脑损伤处GFP标记的细胞呈绿色荧光，移植细胞散在位于损伤灶内，细胞存活。(2)单纯损伤组大鼠觅水时间、重复次数、错误次数等测试结果分别与正常对照组和移植组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；移植组上述指标与单纯损伤组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；移植组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；移植后6周组分别与移植后2周组、4周组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：BMSCs移植能促进TBI后神经功能的恢复，其机制可能与BMSCs分化为神经元和神经胶质细胞有关。

[关键词]创伤性脑损伤；骨髓基质细胞；分化；绿色荧光蛋白；移植

骨髓基质细胞(bone marrow stroma cells，BMSCs)广泛存在于骨髓组织中，是成体干细胞的一种，具有自我更新和多向分化的潜能。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转染的大鼠BMSCs能够表达GFP，解决了细胞标记的问题[1]，在细胞治疗研究中有重要价值。BMSCs可分化为神经元及神经胶质细胞，是脑损伤修复的种子细胞。本研究将体外培养的同种BMSCs用GFP标记后，移植于创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)大鼠模型中，使其分化为神经细胞，通过检测大鼠在不同时间的行为学变化，探讨BMSCs移植对TBI大鼠神经功能恢复的影响，旨在为临床工作中BMSCs移植治疗TBI提供新的实验及理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物及分组选取6周龄清洁级Wistar大鼠50只，随机分为5组，分别为正常对照组、单纯损伤组、移植后2周组、移植后4周组、移植后6周组，每组10只。其中，单纯损伤组和3个移植组的大鼠均复制为中度TBI模型。

1.2方法

1.2.1复制大鼠中度TBI模型单纯损伤组和3个移植组大鼠均采用改进的Feeney自由落体法复制脑损伤模型[2]，在大鼠矢状线左侧做1骨窗，用重40 g的砝码从20 cm高处撞击位于大鼠硬脑膜上的撞杆，致大鼠脑组织发生中度脑挫裂伤。取大鼠脑组织，灌注固定，行苏木精-伊红haematoxylin/eosin，HE)染色，确定损伤程度。

1.2.2BMSCs的体外培养及鉴定无菌条件下分离Wistar大鼠双侧股骨及胫骨，获得原代细胞，进行纯化和扩增，得到第3代BMSCs，进行CD44免疫组化染色。

1.2.3大鼠BMSCs慢病毒转染GFP基因后原位移植将第3代BMSCs进行慢病毒转染，培养24 h后用荧光显微镜观察BMSCs的转染情况。将携带GFP的BMSCs以均分三点的方式注射于脑损伤区。

1.2.4放射形迷宫测试[3]放射形迷宫为木制，参照文献自制。动物在禁水48 h后开始做放射形迷宫测试。测试8次/d，每两次间隔15 min，连续测试4 d。比较各组平均觅水时间、错误次数和重复次数。

1.2.5大鼠脑组织免疫荧光染色分别将移植后2周组、移植后4周组、移植后6周组的大鼠在移植后相应时间点麻醉，进行灌注、固定、取材、切片，进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下，每张切片随机选择5个视野进行细胞计数并观察细胞分化情况。分别检测神经元的标志性蛋白—神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和胶质细胞特异性蛋白—神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)以及微管相关蛋白2的表达情况。

1.2.6统计学处理应用SPSS 13.0软件包完成统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1损伤后脑组织病理学改变将损伤后的脑组织切片进行HE染色，显示为中度损伤。损伤早期，挫伤灶周围神经元可见细胞肿胀、变性、溶解、坏死，周围神经元的数量明显减少；损伤晚期，神经元核皱缩、裂解，出现坏死神经元较前增多。见图1。

2.2BMSCs的培养、传代及CD44染色用倒置显微镜观察，接种后4 h有少量细胞开始贴壁，呈圆形或三角形，2～3 d时贴壁细胞由圆形向长梭形生长，并可见细胞集落形成。随着培养时间进一步延长，细胞体积逐渐增大，细胞核变大。经过第1、第2次传代后，细胞形态趋于一致，贴壁细胞活力增强，生长较前迅速。传3代后，细胞多数呈长梭形，见图2。BMSCs传代至第三代将细胞进行CD44免疫组化染色发现CD44表达阳性，为胞浆着色，见图3。

2.3GFP转染BMSCs及其移植后在脑内的存活情况慢病毒载体介导GFP转染BMSCs 48 h后在荧光显微镜下可以观察到携带GFP基因的慢病毒发出较强的绿色荧光，提示GFP基因已成功转染到BMSCs内并在细胞内高效稳定表达，见图4。分别做移植后2周、4周、6周GFP-BMSCs切片，荧光显微镜下观察，脑损伤处GFP标记的细胞呈绿色荧光，移植的细胞散在位于损伤灶内，细胞存活，见图5。

2.4.1觅水时间比较正常对照组所需时间最短，单纯损伤组所需时间大于正常对照组和移植后各组(P<0.05)，其中移植后6周组觅水时间分别与移植后2周组及移植后4周组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4.2错误次数比较单纯损伤组错误次数大于对照组和移植后各组(P<0.05)，正常对照组错误次数最少，其中移植后6周组错误次数分别与移植后2周组及移植后4周组分别比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4.3重复次数比较单纯损伤组重复次数大于其它各组(P<0.05)，正常对照组重复次数最少，其中移植后6周组重复次数分别与移植后2周组和移植后4周组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠放射迷宫测试结果比较±s)

a为与正常对照组比较P<0.05；b为与单纯损伤组比较P<0.05；c为与移植后2周组比较P<0.05；d为与移植后4周组比较P<0.05

2.5植入BMSCs的体内分化结果原位移植GFP-BMSCs在2周、4周、6周后，取片后在荧光显微镜下观察，脑损伤处GFP标记的细胞呈绿色荧光，移植的细胞散在位于损伤灶内，细胞存活。免疫荧光染色显示BMSCs分别表达NSE，GFAP以及微管相关蛋白2。

3讨论

BMSCs在特定条件下，可跨胚层向神经细胞分化[4]。BMSCs在体内外可稳定表达外源性目的基因，转染目的基因后移植于脑损伤模型，既可表达目的基因又可分化为神经样细胞。利用BMSCs贴壁的特性，经过数次换液和传代后，去掉血细胞使其得到纯化。利用BMSCs的多向分化和自我更新能力、多潜能等特性，参与组织细胞的替代及修复，同时也不存在伦理争议和免疫排斥问题。慢病毒载体由人类免疫缺陷病毒改造而来，转染后大鼠BMSCs的生物学特性和转染前一致[5]。本实验发现，将GFP标记的细胞植入损伤区脑组织后，在移植6周内的切片中均能观察到有表达GFP的细胞存在，说明移植细胞能够在损伤区域内存活。

本实验免疫荧光染色表明BMSCs分别表达神经元的标志性蛋白NSE和胶质细胞特异性蛋白GFAP以及微管相关蛋白2，说明BMSCs在脑内分化成为神经元和神经胶质细胞。放射形迷宫觅水实验证明，移植后2周、4周及6周，远期行为学结果均有所改善，其中，以移植后6周神经功能恢复最好。

综上所述，BMSCs移植能促进TBI所造成的神经功能的恢复，改善远期行为学表现，其机制可能与BMSCs能分化为神经元和神经胶质细胞有关。

参考文献

[1]杜杰,高小青,涂江义,等.绿色荧光蛋白作为骨髓间充质干细胞示踪标记物在脑出血脑内的表达[J].重庆医学，2011,40(14):1364-1366.

[2]Hartyrink KK,Putter H,Klein Kranenbarg E,et al.Value of palliative reason in gastric cancer[J].br J Surg,2002,89(11):1438.

[3]Balduini W,De Angelis V,Mazzoni E,et al.Simvastatin protects against long-lasting behavioral and morphological consequences of neonatal hypoxi/ischemic brain injury[J].Stroke,2001,32(9):2185-2191.

[4]林欣,只达石,张文治,等.骨髓基质细胞和神经干细胞体外共培养的实验[J].天津医药,2011,39(3):247-249.

[5]孟冰,徐延勇,程力维,等.慢病毒载体表达外源PON1对小鼠巨噬细胞的影响[J].武汉大学学报(医学版),2015,36(1):1-5.

Experimental study on bone marrow stromal cell transplantation labeled by green fluorescent protein in traumatic brain injury

ZHAO Xiaocheng, ZHENG Chunfang, FENG Yun, LI Hailong, HAO Fengling, MA Xiaorong, DONG Yufeng

(NeurosurgeryDepartment,TheSecondAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014030,China)

ABSTRACTObjective：To investigate the function and the mechanism of bone marrow stromal cell transplantation in neurologic functional recovery after brain injury.Methods：Traumatic brain injury (TBI) rat models were made ; bone marrow stroma cells (BMSCs) which were successfully cultivated were transferred into the rat models by lentiviral vectors; The Morris water maze test was made. Results：(1) Under fluorescence microscope, among the GFP-BMSCs sections transplanted after 2w, 4w and 6w, the cells labeled by green fluorescent protein (GFP) at the site of the brain injury were in green florencent; the transplanted cells scattered in the lesions and survived. (2) The difference in the time to find water, times to repeat and times to make mistakes for rats between the injured group , the normal group and the transplanted group was statistically significant(P<0.05). There was significant difference between the injured group and the transplanted group(P<0.05).There was no difference between the transplanted group and the normal group(P>0.05). There was significant difference between the transplantation after 2w and the transplantation after 4w and 6w(P<0.05).Conclusion： BMSCs transplantation can promote the recovery of the neurological dysfunction after TBI, the mechanism of which may be related with the fact that BMSCs can differentiate into neorones and neurogliocytes.

KEY WORDSTraumatic brain injury; Bone marrow stromal cells; Differentiation; Green fluorescent protein ; Transplantation

(收稿日期：2015-06-25)