治疗奶牛乳房炎中药混悬型注射剂安全性试验

李诗莹，邹晓，许启有，刘瑶，付世新（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）



治疗奶牛乳房炎中药混悬型注射剂安全性试验

李诗莹，邹晓，许启有，刘瑶，付世新
（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

摘要：为了检验自制中药混悬型乳房注射剂的安全性，试验通过对注射剂热原性、溶血性、肌肉刺激性、皮肤过敏性、急性毒性以及对健康奶牛乳房刺激性进行了全面的考察研究，结果表明该注射剂符合使用动物新兽药的安全性，为临床安全使用该注射剂提供依据。

关键词：奶牛；乳房炎；中药混悬型注射剂；安全性；试验

目前奶牛乳房炎已成为破坏牛奶质量最主要的疾病之一，给畜牧业经济带来重大损失。据有关数据显示，在我国奶牛乳房炎感染率高达70%～80%，其中奶牛隐性乳房炎感染率占46.3%，每年给畜牧业造成1.35亿人民币的损失[1]。随着广大消费者对“无抗”和优质奶源需求的不断提高，如何获得“安全奶”这一问题已引起畜牧业工作者的高度重视。

我国传统中药含有的有效生物成分具有抗菌、活血、清热、消炎、解毒等功能，更主要是病原微生物不易产生耐药性，并且在动物体内高效、低毒、无残留。中药也能增强动物机体的特异性或非特异性免疫力，从而达到有效控制奶牛乳房炎的效果[2]。但是中药成分复杂，并非无任何毒副作用，目前已出现中药制剂产生毒副作用的相关报道。实验中的中药注射剂是一种以甘草总黄酮为主要成分的纯中药混悬型乳房注射剂。根据该中药药效特点及乳房注射的给药方式设计了以下实验，全面评价该中药制剂临床用药的安全性。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物

健康家兔（2.5 kg左右，雌雄各半），由大庆市某实验动物中心提供；小白鼠（22 g左右，雌雄各半），由大庆市某实验动物中心提供；奶牛（泌乳中期）来源于大庆市某牛场，经CMT法检测乳房炎为阴性的健康泌乳期奶牛。

1.1.2试剂

中药混悬型乳房注射剂（吉林大学实验室自制），批号20140501；注射用生理盐水（长春豪邦药业有限公司生产），批号为20140123；2，4—二硝基氯苯（石家庄莫高化学试剂有限公司），批号为20140223；CMT诊断试剂（黑龙江八一农垦大学临床兽医实验室提供）。

1.2试验方法

1.2.1热原检查

通过家兔发热实验法进行检测，并按照《中华人民共和国兽药典（2005年版）》上规定的内容进行[3]。

1.2.2溶血试验

根据《中华人民共和国兽药典（2005年版）》上规定步骤进行中药混悬液是否溶血的试验[3]。

（1）进行2%兔红细胞混悬液的配制

取1只健康家兔，从心脏取血（约20 mL），用玻璃棒匀速同方向搅动（10 min）去除纤维蛋白，然后向血中加入10倍量生理盐水（约180 mL）。继续用玻璃棒混匀后进行离心（1 000～1 500 r·min-1，15 min），然后将上清液弃除，同样方式反复继续用生理盐水清洗4次，直到肉眼观看上清液不显红色停止，最后用生理盐水按所得的红细胞的容积配制成2%的兔红细胞混悬液，供试验用。

（2）溶血与凝集检查

实验前准备5支干净透明玻璃试管并进行编号（1～5），如表1所示1～2号，3号、4号、5号试管依次是供试品管、阴性对照管、阳性对照管、供试药品对照管。按照顺序加入对应试剂和药液后进行混匀，立即放置在的恒温箱（37℃）中，在2h后观察并记录溶血和凝集情况。

表1　溶血实验Table 1Test of hemolysis

1.2.3皮肤过敏性试验

对18只家兔随机进行分组，共分为3组（每组6只），分别为中药混悬液组、2，4—二硝基氯苯对照组和生理盐水对照组。给药前脱毛处理18只家兔（脊柱两侧背部皮肤，左、右各5×6 cm2），处理时注意不要刮伤兔子皮肤。每组家兔分别用1 mL中药混悬液、生理盐水、1%DNCB（2，4—二硝基氯苯）涂于家兔脱毛区皮肤上，无刺激医用纱布覆盖，进行致敏接触。首次给药后在第7 d，第21 d各组分别取出3只家兔，以同样方式进行攻击。各组家兔在6 h给药攻击后用温水擦去皮肤上的受试物，观察皮肤过敏反应情况，记录家兔是否出现抓鼻、竖毛、干咳、休克颤抖、呼吸困难等症状。在24 h再次进行观察并对皮肤红斑和水肿进行评分，评分原则按照表2、表3中的《皮肤过敏反应程度的评分标准》、《皮肤致敏性评价标准》。

表3　供试药对皮肤致敏反应强度分级Table 3Strength rating of skin anaphylactic

1.2.4肌肉刺激性试验

参考《中药药理实验方法》（陈奇，1994）对健康家兔腿部肌内注射法进行研究[4]。

实验前，对健康家兔（2只）的左右两条后腿股四头肌处进行剃毛，并用记号笔标记。对右侧后肢、左侧后肢脱毛处依次注射1 mL中药混悬液和灭菌生理盐水。分别与24、48 h后，观察注药部位的反应变化情况，在48 h后处死家兔，取出并用手术刀纵向切开股四头肌，观察内部肌肉组织注射部位的刺激反应及药液吸收情况，如果需要进行可疑组织做病理切片。反应结果按表4分级。

表4　中药混悬型注射液对家兔腿部肌肉组织反应分级Table 4Anaphylaxis scores of muscle tissue of chinese medicinal herbs suspension injection on rabbit

1.2.5急性毒性试验

1.2.5.1预试验

取24只雌雄各半、禁食16 h左右的小鼠，随机分成四组。分别为中药高0.4 mL（20 g小鼠最大给药剂量）、中0.2 mL、低0.1 mL剂量组、生理盐水对照组。每组给药方式均为腹腔注射药物一次。给药后连续观察至第七天，无一例死亡，具体结果见表5。由于供试小鼠均未出现不良反应，难以测得半数致死量（LD50），故采用最大给药量（MLD）的测定方法进行正式试验。

表5　急性毒性试验预试验Table 5　Pre-test of acute toxicity test

1.2.5.2正式试验

根据预试验结果说明中药混悬液毒性很低，因此采用24 h内3次给药的方法测定药物的最大给药剂量。取禁食12 h的小鼠40只，分为中药给药组、生理盐水对照组。称重后经腹腔注射中药，每8个h给药一次，每次0.4 mL，生理盐水组给药方式一样，进行毒性观察。连续观察一周，第7 d处死并剖检全部小鼠，记录小鼠内脏（心、肝、肺、肾）的病理变化。

1.2.6健康奶牛乳房刺激性试验

1.2.6.1刺激性试验方案

选择12头四个乳区CMT检测均为阴性，乳汁中未分离到细菌，奶牛在1个月内没有灌注抗生素的健康泌乳期奶牛，随机分成四组，每组3头。A组为30 mL中药试验组，B组为60 mL中药试验组，C组为100 mL中药试验组，D组为100 mL生理盐水对照组。试验组均在早上挤奶完毕后，分别以不同的剂量将中药混悬型注射剂灌注到左前乳区，灌注一次，对照组以100 mL生理盐水灌注到左前乳区。注射后24 h、48 h、72 h、96 h，1周观察奶牛乳房的外观，并采集药物灌注乳区奶样50 mL，12 h内送检。1.2.6.2检测指标

在给药后24、48、72 h，1周观察乳房的变化情况，记录奶牛乳房是否红、肿、热、痛或激痒的反应，同时测量其体温，待乳汁中无药残留及药液完全吸收后观察奶牛的乳房及全身变化情况，判断中药混悬液对乳腺组织有无刺激性伤害。采集乳样，观察给药前后乳汁变化，是否凝块，并采集乳汁进行体细胞计数。

2　结果与分析

2.1热原检查

热原检查结果见表6。试验过程中家兔的体温变化均不明显，每只家兔的体温升高均小于0.6℃，3只家兔体温升高总和在1.4℃以下，表明该自制中药混悬型注射剂的热原测定符合兽药典的规定。

表6　对中药混悬型注射剂热原检查结果Table 6Results of chinese medicinal herbs suspension injection on rabbit body temperature

2.2溶血与凝集检查

试验结果为：3号阴性对照管中均未见溶血和红细胞凝集现象发生；4号阳性对照管管底无红细胞残留，溶液红色透明，证明发生全溶血；5号管中药颜色未发生变化，仍为黄色，澄明度很高；1、2号供试药品试验管中，可以观察到红细胞均下沉，上清液无色澄明，证明无溶血和凝集，以上结果证明该中药混悬型注射剂无溶血和凝集性。

2.3皮肤过敏性试验结果

过敏性试验结果显示，家兔在涂抹2，4—二硝基氯苯后致敏率为100%，属于极强度致敏物。家兔在涂抹中药混悬液后皮肤均未出现水肿、红斑现象，并且没有出现哮喘、站立不稳、休克等全身性过敏症状，致敏率为0%，证明该药属于弱致敏物。

2.4肌肉刺激性试验结果

两只兔子在48 h处死后，解剖取出的股四头肌进行纵向切开，经观察中药注射部位的肌肉组织与生理盐水注射的对照部位肌肉组织没有明显病理变化。中药混悬型注射剂对肌肉的刺激性实验结果为两只家兔的平均反应级数在2以下，可供肌肉注射之用。

2.5急性毒性试验结果

通过预试验，无法进行LD50的计算。因此采用给予动物理论能够接受的最大浓度下的最大体积进行毒性测定的方法，通过观察7 d内是否产生不良反应。经过异常毒性正式试验，发现死亡小白鼠为0只，对生理盐水组和中药混悬液低剂量组的小白鼠进行对比观察，发现两组小鼠反应无差别，精神状态和食欲都未出现异常；虽然中药组中剂量、高剂量组的小鼠给药后精神稍微不振，被毛有些凌乱且缺少光泽，食欲也不是最好状态，但是第二天状态好转，所有小鼠均恢复正常。以上结果说明该中药混悬型注射剂毒性极小，符合临床使用安全性。

2.6奶牛乳房刺激性试验结果

由表7可以看出，A组～D组的奶牛左前乳区乳房外观与乳汁外观都没有什么变化；乳汁体细胞数是评价生鲜乳质量和奶牛健康状况的重要指标[5]，采用独立样本t检验结果表明（表8）100 mL最高剂量的中药组和100 mL剂量的生理盐水对照组乳汁体细胞数相同天数间无显著差异（P＞0.05），证明该中药混悬液对奶牛乳房炎的刺激性与生理盐水刺激程度相同，间接证明此中药混悬型注射剂对奶牛乳房刺激性不大，30 mL、60 mL剂量均安全，所以每个乳区注射剂量在100 mL以下均可作为以后治疗的剂量筛选参考。

表7　给药后不同乳区临床症状的变化Table 7Mammary change of different clinical symptoms after administration

表8　100ml组给药前后乳汁体细胞数差异表达量Table 8Differences expression of somatic number 100 mL of milk several around administration

3　讨论

奶牛乳房炎是由病原微生物侵入、物理性刺激及机械性损伤所致，以乳房实质、间质发生炎症为主要症状的一种奶牛常患疾病[6]。目前抗菌是我国治疗各种类型乳房炎的主要方法。常用的抗菌药物包括青、链霉素、头孢菌素、红霉素类、地塞米松庆大霉素、四环素、喹诺酮类、磺胺类等，给药方式包括全身给药和乳房局部给药。抗生素是乳房炎治疗的常规药物，但是由于抗生素在治疗乳房炎中的不合理利用，抗生素的诸多缺点越来越突出，比如抗生素在乳腺的分布较差；导致细菌耐药性的形成；引起乳腺的免疫机能下降等[7-11]。

随着中药治疗奶牛乳房炎研究的不断深入，中药剂型选择的合理性也在不断完善。目前，用来防治奶牛乳房炎的中药剂型主要被制成散剂、新型乳房透皮剂、乳房注射剂等。乳房注射剂就是将药物与合适的溶剂或分散介质通过现代工艺制成的用于乳管注入的无菌制剂，可以为溶液、乳状液、混悬液等型，这种给药方式方便迅速，最大可能的降低了药物有效成分的损失[3]。混悬液型是一种缓释制剂，缓释制剂用于注射时不仅使用方便，用药一次更可维持数日，从而提高工作效率。药物在乳区内可以分布均匀，释放均匀，可维持较长时间的药物浓度，获得平稳持久疗效。

由于受到多方面因素如药物的品种、产地、采收季节、处方组成、提取方法、药物剂量以及给药途径等影响，所以中药并非无毒副作用，因此对中药制剂进行安全试验是必不可少的。实验中自制的中药混悬型乳房注射剂是用于治疗奶牛乳房炎的一种纯中药制剂，根据其剂型和给药途径进行了热原性、溶血性、过敏性、刺激性进行了研究，结果表明，该中药混悬型注射剂热原测定符合规定；对家兔皮肤致敏率为0%，属于弱致敏物，符合临床用药规定；对家兔腿部肌肉无明显刺激性；对小鼠未产生急性毒性反应；对健康奶牛乳房刺激性试验证明该中药混悬型乳房注射剂对奶牛乳房的刺激性与生理盐水刺激程度相同，证明此中药注射剂对奶牛乳房刺激性不大。以上结果证明该中药混悬型乳房注射剂符合临床用药安全性。

参考文献：

［1］Li J P，Zhou H J，Yuan L，et al.Prevalence，genetic diversity，and antimicrobial susceptibility profiles of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Zhejiang Province，China［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10（10）：753-760.

［2］潘翠翠，郭永霞，王艳丽，等.甘草提取物对5种植物病原菌的抑菌作用［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26 （3）：1-4.

［3］国家药典委员会．中华人民共和国药典［M］.2部.北京：化学工业出版社，2005.

［4］陈奇.中药药理学实验方法［M］.北京:人民卫生出版社，1994.

［5］于洪远，黄继卓，沈新丽，等.奶牛乳体细胞数变化及影响因素调查［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（1）：46-49.

［6］吕玉卓，杨剑锋.中西医结合治疗奶牛乳房炎［J］.黑龙江畜牧兽医，2011（3）：93-94.

［7］齐长明．乳牛疾病学［M］.北京：中国农业出版社，2005.

［8］白蜂，王文魁，王广彬，等.22味中草药对3种奶牛乳腺炎病原菌的体外抑菌试验［J］．中国奶牛，2010（2）：39-41.

［9］李卫平，曾双桥.中西医结合治疗奶牛乳房炎［J］.贵州畜牧兽医，2010，34（4）：38-39.

［10］夏全，张平，李绍平，等.当归的药理作用研究进展［J］.时珍国医围药，2004，15（3）：39-44.

［11］郭梦尧，王洪海，王国卿，等.奶牛乳房炎的病理机制及中药防治研究进展［J］.动物医学进展，2010，31（10）：92-95.

Safety Study of Self-made Chinese Medicinal Herbs Suspension Injection for Dairy Cattle with Mastitis

Li Shiying，Zou Xiao，Xu Qiyou，Liu Yao，Fu Shixin （College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Abstract:In order to test the safety of suspension breast injection of self-made chinese medicinal herbs，the temperature sensitivity，haemolyticus，irritation，sensitization，acute toxicity and udder irritation were researched to provide evidence for the clinical use.The results showed that the injection was in line with animal safety use，which provided the basis for clinical safe use of suspension injection.

Key words：dairy cattle；mastitis；chinese medicinal herbs suspension injection；safety；experiment

中图分类号：S8

文献标识码：A

文章编号：1002-2090（2016）01-0019-06

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.005

收稿日期：2015-03-04

作者简介：李诗莹（1990-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2013级硕士研究生。

通讯作者：付世新，女，教授，博士研究生导师，E-mail：fushixin@163.com。