超声辅助川黄柏中黄柏碱的提取与含量测定的研究*

赵伟杰，李　伟，张　晶*（.台州职业技术学院生物与化工学院，浙江台州38000；.浙江新东港药业股份有限公司，浙江台州38000）



超声辅助川黄柏中黄柏碱的提取与含量测定的研究*

赵伟杰1，李伟2，张晶1*
（1.台州职业技术学院生物与化工学院，浙江台州318000；2.浙江新东港药业股份有限公司，浙江台州318000）

摘要：目的：超声辅助提取川黄柏中黄柏碱，并利用HPLC法测定川黄柏中黄柏碱的含量。方法：色谱条件：选用Agilent zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm），流速1mL·min-1，柱温40℃,检测波长284nm。结果：回归方程：Y=150.640643X-1.8811429，r=0.99992，线性范围：0.8144～4.0720μg·μL-1，平均回收率为101.31%，RSD=1.24%。结论：超声辅助提取可以明显提高川黄柏中黄柏碱的提取率，并且经过系统的方法学考察，该方法具有简便、稳定、可重复的特点，为川黄柏药材质量控制和评价提供了参考依据。

关键词：川黄柏；黄柏碱；HPLC；超声提取

黄柏具有非常悠久的药用历史，是临床应用最为广泛的中药之一。黄柏来源于芸香科植物黄皮树的干燥树皮，作为中药黄柏的基源载入2000年版和2010年版《中国药典》,分别为通常所称的关黄柏和川黄柏［1-3］。川黄柏在我国分布较广，主要产于四川、湖北、贵州、云南、陕西、广西等地［4,5］。川黄柏是常用的传统中药材，主要活性部位含有小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、黄柏碱等季铵型生物碱，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮等功效［6］现代药理学研究表明，黄柏具有抗菌、抗真菌、抗炎、抗肝炎、抗肾炎、抗溃疡、抗氧化、抗痛风、降血压、降血糖、抗肿瘤、抗心力衰竭、抑制细胞免疫等作用［7-13］。黄柏碱作为黄柏药材的特征性成分和重要活性成分，目前，已广泛应用于黄柏药材及中药制剂的质量控制，且其药理活性显著。研究发现黄柏碱在降血压、抗肾炎、抑制细胞免疫反应、中枢神经抑制等方面均具有显著效果，尤其在抑制细胞免疫方面的显著效果，且可将其作用应用于抗过敏、舒缓肌肤等化妆品中。因此，对于黄柏碱的深入研究与开发将具有非常广阔的应用价值和市场前景。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率40kHz，功率250W）；循环水式真空泵（台州市信力电子设备有限公司）；安捷伦高效液相1260；电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；30B型万能粉碎机（江阴市鑫达药化机械制造有限公司）。

乙腈为色谱纯（Sigma-Aldrich公司）；实验用水为超纯水，其它试剂均为分析纯；川黄柏药材（批号：12072001，安徽颐生堂中药饮片有限公司）；盐酸黄柏碱对照品（批号111895-201303，中国生物制品检定所）。

1.2色谱条件

色谱柱为Agilent zorbax SB-C18柱（150 mm× 4.6mm，5μm）；流动相为乙睛-［0.05 mol·L-1KH2PO4-三乙胺（用H3PO4调pH值为4）］（10∶90∶0.3）；检测波长284nm，流速1mL·min-1，柱温40℃。

1.3对照品溶液

精密称取盐酸黄柏碱适量，加乙腈溶液制成0.2036mg·mL-1溶液，作为对照品溶液。

1.4供试品溶液

精密称定黄柏碱粉末，加入乙腈溶解，通过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

2　结果与讨论

2.1超声辅助提取工艺研究

2.1.1超声功率的考察称取川黄柏小片20.0g，加入提取溶剂HCl-70%乙醇（1∶100），料液比为1∶20g·mL-1，超声功率分别为100、250和450W，超声温度为40℃，超声60min，趁热抽滤。加入HCl调至pH值为2，再加一定浓度的NaCl水溶液搅拌，静置，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得黄柏碱粉末。将黄柏碱粉末用乙腈溶解，通过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液10μL进样测定，提取率分别为2.96%、4.62%、4.05%。

图1　超声功率对提取率的影响Fig.1　 Effect of ultrasonic power on extraction rate

由图1可知，提取率随着功率增加呈现先增大后减小的趋势，在功率为250W时提取率较高。

2.1.2超声温度的考察超声功率选取250W，超声时间60min，超声温度分别选取20、40、60、80℃来考察超声温度对黄柏碱提取率的影响。

图2　超声温度对提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate

由图2可知，提取率分别为3.46%、4.62%、5.35%、4.78%。结果表明，提取率随着温度增加也呈现先增大后减小的趋势，在温度为60℃时提取率较高。

2.1.3超声时间的影响超声功率为250W，超声温度为60℃，超声时间分别为30、40、50、60，70min来考察超声时间对黄柏碱提取率的影响。

图3　超声时间对提取率的影响Fig.3　 Effect of ultrasonic time on extraction rate

由图3可知，提取率分别为4.46%、5.12%、5.98%、6.09%、6.12%。结果表明，提取率随着时间增加而增大，但超声50min后提取率变化幅度较小，因此，考虑提取时间50min为宜。

2.1.4超声辅助提取方法称取川黄柏小片20.0g，加入提取溶剂HCl-70%乙醇（1∶100），料液比为1∶20g·mL-1，超声功率为250W，超声温度为60℃，超声时间为50 min，趁热抽滤。加入HCl调至pH值为2，再加一定浓度的NaCl水溶液搅拌，静置，过滤，用水洗涤沉淀，干燥，得黄柏碱粉末。将黄柏碱粉末用乙腈溶解，通过0.45μm微孔滤膜过滤得供试品溶液，进样10μL测定。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系考察精密吸取盐酸黄柏碱对照品溶液4、8、12、16、20μL，注入高效液相色谱仪，以乙腈-［0.05mol·L-1KH2PO4溶液-三乙胺（磷酸调pH值为4.0）］（10∶90∶0.26）为流动相，用1.2色谱条件测定峰面积，黄柏碱浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归处理，回归方程：Y= 150.640 643X-1.8811429，r=0.99992，说明线性关系良好，线性范围：0.8144～4.0720μg·μL-1。

2.2.2精密度试验精密吸取黄柏碱对照品溶液，重复进样5次，每次10μL，测得黄柏碱峰面积峰的RSD=1.1%,说明本方法具有良好的精密度。

2.2.3稳定性试验分别于0,2,4,8,12,24,36,48h,精密吸取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,测得的黄柏碱峰面积RSD=0.73%,结果表明供试液在48h内是稳定的。

2.2.4重现性试验精密称取同一批川黄柏药材样品5份,每份约5g,按供试品溶液制备方法及色谱条件进行黄柏碱含量测定,RSD=1.46%,可见本方法有良好的重复性。

2.2.5回收率试验取川黄柏5份,每份约5.0g,精密加入盐酸黄柏碱对照品适量,每份样品进样10μL,按照HPLC条件进行含量测定,计算平均回收率为101.31%, RSD= 1.24%。

2.2.6黄柏碱的含量测定取供试品溶液1mL，经0.45μm微孔过滤器过滤进样瓶中，在“1.2”项色谱条件进行测定外标法计算，即得样品中黄柏碱的质量分数5.98mg·g-1。色谱图见图4。

图4　盐酸黄柏碱对照品溶液（A）、供试品溶液（B）和阴性对照液（C）的HPLC图Fig.4 HPLC chromatograms of reference substance, sample（B）and negative control（C）

3　小结

本文采用超声辅助从川黄柏中提取出黄柏碱,并通过高效液相色谱检测其含量，经实验证明，该检测方法具有简便、快速、稳定、可靠、可重复的特点，为川黄柏药材质量控制和评价提供了参考依据。

参考文献

［1］周松,刘永刚,张国祥,等.黄柏化学成分及质量控制研究进展［J］.中国药房,2012,23（39）:3740-3742.

［2］中华人民共和国药典（一部）［M］.北京:化学工业出版社,2000. 251-252.

［3］中华人民共和国药典（一部）［M］.北京:中国医药科技出版社, 2010.286-287.

［4］廉莲,咸晓燕,楚冬海,等.川黄柏的化学成分研究［J］.中国实验方剂学杂志,2013,19（19）:149-152.

［5］沈力,付绍智,马羚,等.川黄柏野生资源调查研究［J］.中国野生植物资源,2009,28（4）:25-59.

［6］李红玲,莫炫永.HPLC法同时测定川黄柏中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱的含量［J］.中国药房,2014,25（27）:2562-2564.

［7］梁园园,于天浩,等.黄柏的药理活性及在化妆品中的应用［J］.辽宁中医药大学报，2013,15（1）:149-151.

［8］嘉瑞,张冰,张光敏.黄柏药理作用研究进展［J］.亚太传统医药. 2009,5（11）:160-162.

［9］Mori H,Fuchigami M,Inoue N,etal.Principleofthe bark of Phellodendron amurense to suppressthe cellularimmuneresponse［J］.Plantamed,1994,60（5）:445-449.

［10］廖静,鄂征,聂毓秀，等.中药黄柏的光敏抗癌作用研究［J］.首都医科大学学报,1999,20（3）:153-155.

［11］吴达荣,郑有顺,苏用波.黄柏对幽门螺杆菌的抑菌临床研究［J］.华南药讯,1995，（4）:30.

［12］张志军.黄柏提取物的抗溃疡效果［J］.国外医学（中医中药分册）,1994,16（1）:29.

［13］宏君.培育捆束水浸应激性溃疡易发系小鼠以及黄柏提取物成分的药理遗传学解析［J］.国外医学（中医中药分册）,1992,14 （1）:52.

Abstrcat：Objective：The phellodendrine was extracted by ultrasound assisted and the content was determined by HPLC method. Methods：The chromatographic conditions were:Agilent zorbax SB-C18column（150mm×4.6mm，5μm）, flow rate being 1mL·min-1, column temperature 35℃, detection wavelength at 284nm for phellodendrine. Results：The regression equation: Y=150.640643X-1.8811429, r=0.99992, the linear range：0.8144～4.0720μg·μL-1, the average recovery was 101.31%, RSD=1.24%.Conclusion Ultrasonic assisted extraction can improve the extraction rate of phellodendrine and after the system of methodology, the method has the characteristics of simple, stable, repeatable, provides the reference for the quality control and evaluation of Cortex Phellodendri.

Study on the extraction and content determination of phellodendrine in cortex phellodendri*

ZHAO Wei-jie1，LI Wei2，ZHANG Jing1
（1.Department of Biological & Chemical Engineering; Taizhou Vocational & Technical College,Taizhou 318000，China; 2.Zhejiang Neo-Dankong Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000，China）

Key words：cortex phellodendri；phellodendrine；HPLC；ultrasonic extraction

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160424

收稿日期：2016-01-22

基金项目：台州市科技计划项目（No.1301ky58）

作者简介：赵伟杰（1978-），男，汉族，讲师，主要从事无机、有机及分析化学教学和科研工作。