沼泽红假单胞菌16SrDNA PCR快速检测方法研究

王妍力，耿亚亚，郝葆青（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）



沼泽红假单胞菌16SrDNA PCR快速检测方法研究

王妍力，耿亚亚，郝葆青*
（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

摘要：目的：依据反映光合菌物种属性和高度保守性的16S rDNA序列，设计其特异性引物，优化并确定PCR反应条件，探索沼泽红假单胞菌快速鉴别的方法。方法：提取沼泽红假单胞菌菌体染色体DNA，分离和纯化；从GenBank分别获取假单胞菌属、大肠杆菌和诺卡氏菌属的16S rDNA基因序列，分析比较并确定其可变区的基因序列片段，设计种属特异引物；对影响PCR扩增的因素进行分析和预试，确定PCR扩增的最佳条件；随后进行PCR扩增试验，对其产物克隆测序，同时进行沼泽红假单胞菌形态特征和生化特性的检测。结论：以16S rDNA的种属特征序列设计引物，PCR扩增检测沼泽红假单胞菌样本的方法，特异强、灵敏度高、重复性好、操作性强、价格低廉；从分离提取样本DNA到完成PCR扩增，可在3h左右对沼泽红假单胞菌作出鉴定。

关键词：沼泽红假单胞菌；16S rDNA；引物；PCR扩增；条件优化；诺卡氏菌属

按照《伯杰细菌鉴定手册》［1］分类，光合细菌分为45种，沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）属于光合细菌分类中的红螺菌科、红假单胞菌属。沼泽红假单胞菌广泛存在于自然界，具有原始光能合成体系，可在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等进行光合作用［2-4］。沼泽红假单胞菌因具有复杂而多样化的代谢功能等特性，可产生丰富的营养和生理活性物质，已广泛地应用于农业、渔业、环保、医药等领域。以沼泽红假单胞菌为菌种生产的微生物肥料产品在水稻、蔬菜、果树和烟草等作物上都取得了较好的效果［5-7］。研究表明，该类光合细菌具有改善土壤结构与营养状况、提高作物抗病防病能力、提高作物的光合作用和作物品质等功效［8-8］。近年来沼泽红假单胞菌在各行各业的应用迅速增加，其质量和数量是确保相关产品安全有效的关键，因此，建立该菌的快速检测技术是很重要的。

本文针对原核生物16S rDNA碱基序列具有保守性、不易受环境变化影响等特性，将假单胞菌属中10种菌的16S rDNA序列与大肠杆菌和诺卡氏菌属（Nocardiopsis sp）的16S rDNA序列作对比，选择其差异性显著的碱基序列片段进行引物设计，以此来探索沼泽红假单胞菌的快速检测方法。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种沼泽红假单胞菌菌株由西南民大生命科学与技术学院细胞生物实验室提供，大肠埃希氏杆菌菌株AB80054由该学院微生物实验室提供。

1.1.2培养基与试剂基础培养基：酵母膏3.0 g，蛋白胨5 g，琼脂8 g，氯化钠2.0 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水1000mL，pH值6.8，121℃灭菌20min［6］。

沼泽红假单胞菌培养基（富集培养液）：乙酸钠3.0g、丙酸钠0.3g、NaCl 1.0g、（NH4）2SO40.3g、MgSO40.2g、KH2PO40.5g、K2HPO40.3g、CaCl250mg、MnSO42.5mg、FeSO45 mg、酵母膏0.1 g、蛋白胨10mg、谷氨酸0.2mg、蒸馏水1000mL，pH值7.4，121℃灭菌30min。若配制固体培养基则需再加入17g琼脂，灭菌、制平板。

其他试剂：Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程公司生产）、TAE，2×Taq PCR MasterMix PR080530购自成都天根生物试剂公司。

1.2试验方法

1.2.1菌株的富集与纯化取试样沼泽红假单胞菌2mL于5mL试管中，塞紧，30℃、2000 Lx光照、厌氧条件下培养48h。菌落计数，以确定原菌液浓度。

采用涂布法对试样菌进行分离纯化：取0.1mL试样菌液进行过滤除杂，采用富集培养液稀释至1mL，重复过滤操作3次，用移液枪吸取0.1mL接种于平板培养基上，涂匀。待30 min菌液渗透进平板后，用基础培养基覆盖以造成厌氧环境，用封口胶把平板密封好放入光照培养箱中30℃、2 000 Lx光照下培养24～48h。然后挑选红色单个菌落接种于装有25mL富集培养液的三角培养瓶中，并在上述同样条件下培养7～8d，直至整个培养液变红色或红褐色，即得纯种菌株，取名S1菌株。菌落计数，确定其菌液浓度。4℃保存备用（可保存1周）。

1.2.2菌落及菌体的形态观察挑取平板培养的S1菌株的单个红色菌落，革兰氏染色，在显微镜下观察菌落形态特征、染色状态。参照《伯杰细菌鉴定手册》［1］进行形态学鉴定。

1.2.3沼泽红假单胞菌DNA的提取取1mL过夜培养的S1菌液于1.5mL离心管中，室温8000r/min离心1min，弃上清，收集菌体。加入180μL Buffer Digestion（BD），再加入20 μL Proteinase K溶液，振荡混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解。加入200μL BD液，充分点到混匀。再加入200μL无水乙醇，充分点到混匀。将吸附柱放于收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500 μL PW Solution，10000r/min离心30s倒掉滤液。再将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，10000r/min离心30 s倒掉滤液。又将吸附柱重新放回收集管中，12 000 r/min室温离心2 min，离去残留的Wash Solution。取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入70μL CE Butter，静置3min，12000r/min室温离心2min，收集DNA溶液。-20℃保存。

1.2.4引物设计由GenBank选取沼泽红假单胞菌属及其相近属共10种16S rDNA基因序列，利用DNAMAN软件将它们分别与大肠杆菌和诺卡氏菌属的16S rDNA序列作比较分析，确定和定位其可变区的基因序列片段。用引物设计软件Primer 5在定位区域设计引物，引物合成由成都华达科技公司完成。

1.2.5PCR扩增条件的优化采用上述引物，以S1菌株染色体DNA为模板分别进行PCR反应时间和温度等条件的优化。在25μL反应体系中，分别设置不同的4个时间梯度水平和温度梯度水平进行PCR扩增反应循环试验，方法参见肖亦农等［11］。根据不同时间和温度组合的PCR反应结果，确定出现目的条带最清晰的时间和温度最优组合。

1.2.6扩增及产物回收选取PCR反应的最佳条件进行扩增试验，扩增反应采用25μL体系：DNA模板1μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，2×Taq Master-Mix 12.5μL，ddH2O 8.8μL。反应程序（最佳扩增条件）：85℃3min，84℃20s、65℃20s、72℃1min（共35个循环），72℃8min。

反应所得产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察，PCR Fragment Recovery Kit回收，并送往成都华达科技公司测序。

2　结果与分析

2.1富集培养特征将S1菌株的试样菌液接种于富集培养液中培养，第3d可以明显观察到菌液出现白色浑浊的絮状沉淀；第5d就可以观察到菌液呈现浅红色。每隔24h振荡晃动一次，经过2～3次的转富集培养，就可以见到明显的浅红色或红褐色菌液。

2.2菌株镜检该菌液呈深红色，黑暗好氧培养后呈浅红色，平板上单菌落在单层平板上呈乳白色，灯光下呈橘红色。阴性菌革兰氏染色后呈红色，阳性菌呈紫色。厌氧培养条件下，固定平板上该菌落为棕红色，菌落呈凸起状，表面光滑、湿润、有光泽，边缘整齐。该菌经革兰氏染色、镜检，结果为阴性菌，形态呈短杆状或卵形两端钝圆。

2.3引物设计选取沼泽红假单胞菌S1菌株与假单胞菌属的另外10种菌株的基因序列（从GenBank获取），运用Mega5.0构建进化树，结果显示它们的同源性平均都在88%以上。采用BLAST程序将沼泽红假单胞菌株的16S rDNA序列分别与大肠杆菌、诺卡氏菌属的16S rDNA序列进行相似性分析，结果显示它们的同源性较低，其差异性序列即为沼泽红假单胞菌的种属特征基因片段。以此设计引物：上游引物F序列为5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物R序列为5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇。2.4 PCR扩增条件的优化聚合酶链式反应（PCR）虽然具有很高的特异性和敏感性，但由于反应条件不合适，仍然有假阳性。PCR扩增反应循环设置见图1。在图1中，①采用肖亦农等［11］的方法，为比照试验；

图1　PCR扩增条件优化结果

②③④为PCR优化条件试验。试验结果表明，在扩增条件①②③中，其目的条带不清晰，特异性不强，有杂带。只有扩增条件④的条带清晰，特异性强，故④为最优化扩增条件。

2.5 PCR扩增对沼泽红假单胞菌S1菌株的染色体DNA进行PCR扩增，用PCR Fragment Recovery Kit回收目的产物DNA片段，结果见图2。对其产物DNA片段进行测序，结果显示长度为1432bp。将该结果与沼泽红假单胞菌及其菌属的16S cDNA序列（1500bp）作比较，得出条带大小相符。因此，可判定此S1菌株为沼泽红假单胞菌。

图2　菌株S1扩增产物电泳图

3　讨论与结论

在本实验条件下，沼泽红假单胞菌显示了色彩、形态等方面的变化。厌氧光照培养，菌液由淡黄色浑浊絮状沉淀逐渐变为淡红色，一周左右成为红色或红棕色培养物；好氧培养平板上，单菌落在单层平板上呈乳白色；厌氧培养菌落为棕红色，并呈凸起状，表面光滑、湿润、有光泽，边缘整齐；然后经革兰氏染色、镜检，结果为阴性菌，形态呈短杆状或卵形两端钝圆。

同源性分析结果显示，菌株S1与10种同属菌株的同源性平均达到88%以上，与大肠杆菌和诺卡氏菌属的同源性较低。由于16S rDNA序列具有保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定性，进行同源性较低菌种间的16S rDNA序列比较，其差异性序列在沼泽红假单胞菌种中的重现性极高，因此可将此序列作为该菌种鉴别的特征序列。采用这种16SrDNA中的特征序列进行扩增分析，结合形态鉴别的方法即可实现对沼泽红假单胞菌快速、灵敏、微量、准确、简便的检测与鉴定。本方法具有独特的优点，特异性强、便于操作、重复性好。从分离纯化样本DNA到扩增产物的鉴别，只需3h左右即可完成，可最大程度地满足光合细菌产品质量检测的准确性和时效性。

参考文献：

［1］Buchanan RE.伯杰细菌鉴定手册［M］.8版.北京：科学出版社，1874.

［2］刘茵，王运吉，曹方，等.光合细菌培养研究［J］.大连轻工业学院学报，1883（2）：37-38.

［3］Zhu X，Xie X，Liao Q. Enhanced hydrogen production by Rhodopseudomonas palustris CQK 01 with ultrasonication pretreatment in batch culture［J］. Bioresour Technol，2011，102（18）：8686-8688.

［4］Simon Scheuring，Rui Pedro Goncaves，Valerie Prima，et al. The photosynthetic apparatus of Rhodopseu -domonas palustris：structures and organization［J］. J Mol Biol，2006，358（1）：83-86.

［5］王秋菊.光合细菌在植物上的研究现状与展望［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2006，18（5）：25-28.

［6］古军，杨旭.光合细菌菌肥在蔬菜种植上的应用［J］.黑龙江农业科学，2002（6）：4-6.

［7］魏克强，杨俊仙，魏治中.光合细菌改善新型烟草品质的初步研究［J］.微生物学通报，2008，35（2）：220-224.

［8］张信娣，曹慧，徐冬青，等.光合细菌和有机肥对土壤主要微生物类群和土壤酶活性的影响［J］.土壤，2008，40（3）：443-447.

［8］张信娣，史永军，陈银科.光合细菌和有机肥对土壤主要微生物类群的影响［J］.中国土壤与肥料，2007（3）：102-105.

［10］Lurid P A. Microbial molecular chaperones［J］. Adv Microbr＇hysiol，2001，44：83-140.

［11］肖亦农，崔艺久，徐琼，等.一种新沼泽红假单胞菌鉴定及其类胡萝卜素含量分析［J］.科技导报，2013，31（13）：58-62.

Study on the Detection Method of Rhodopseudomonas Palustris with 16S rDNA PCR

WANG Yanli，GENG Yaya，HAO Baoqing*
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

Abstract：Objective：according to the species attributes and highly conservation of 16S rDNA sequence of photosynthetic bacteria，the specific primers were designed，and the PCR reaction conditions were optimized，in order to explore the identifying methods to Rhodopseudomonas palustris. Method：the chromosomal DNA was extracted from Rhodopseudomonas palustris cell，and it was isolated and purified. The 16S rDNA gene sequences of the Pseudomonas genus，Escherichia coil and Nocardiopsis sp came from the GenBank respectively，and the gene sequence fragments of variable region were analyzed and compared with each other for the design of the species-specific primers. Several factors that may affect the PCR amplification were analyzed，and also some pre-tests were done in order to determine the best conditions for the PCR amplification. And then the PCR amplification was done，the PCR products were cloned and sequenced. Meanwhile morphological and biochemical characteristics of Rhodopseudomonas palustris were tested. Conclusion：the method was developed to detect Rhodopseudomonas palustris by PCR amplification with species-specific primers，which had the properties of strong specificity，high sensitivity，good repeatability，high maneuverability and low price. The whole process from extracting the DNA to the PCR amplification was about 3h for identifying the strains of Rhodopseudomonas palustris.

Key words：Rhodopseudomonas palustris；16S rDNA；Primer；PCR amplification；Optimizing conditions；Nocardiopsis sp

中图分类号：Q83-331，Q838.112

文献标识码：B

文章编号：1001-8864（2016）05-0020-02

收稿日期：2016-03-02

基金项目：西南民族大学研究生创新型科研项目（CX2015SP468）；四川省教改项目“兽医专业学位研究生教育实践基地建设”。

作者简介：王妍力（1881-），女，四川成都人，兽医硕士，研究方向：兽医疾病预防。

*通讯作者：郝葆青（1856-），男，教授，博士。