Notch信号通路调控哮喘小鼠气道上皮下纤维化*

胡　美，　许欣婷，　李红梅，　李珊珊，　吴昌归

(1解放军第306医院呼吸与危重症医学科，北京 100101； 2第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科，陕西 西安 710032)



Notch信号通路调控哮喘小鼠气道上皮下纤维化*

胡美1,2▲，许欣婷2▲，李红梅1，李珊珊1，吴昌归2△

(1解放军第306医院呼吸与危重症医学科，北京 100101；2第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科，陕西 西安 710032)

[摘要]目的： 探讨Notch信号通路在哮喘上皮下纤维化中的调控作用。方法: 首先针对I型胶原蛋白启动子进行生物信息分析，了解有无Notch信号通路结合位点；其次通过DNA-pull down及Western blot 实验来证实Notch信号通路下游关键分子Hes1与人和小鼠I型胶原蛋白亚型基因有无结合;最后建立哮喘小鼠模型，用免疫荧光检测哮喘小鼠肺中I型胶原蛋白2个亚型在肺组织中的分布情况，并予Notch信号通路抑制剂KyoT2腺病毒载体经鼻干预，通过EVG染色观察哮喘气道上皮下纤维化情况。结果: 生物信息学分析证实I型胶原蛋白2个亚型的启动子转录位点附近均存在Notch下游关键分子Hes1的结合位点。 DNA-pull down及Western blot实验证实Hes1蛋白结合于I型胶原蛋白启动子转录位点附近。哮喘小鼠模型中I型胶原蛋白的2个亚型在肺组织中的表达较正常对照组增多，差异有统计学显著性(P<0.05)。哮喘小鼠模型经Notch抑制剂干预后肺组织中胶原纤维减少,气道上皮下纤维化得到缓解。结论: Notch能调控哮喘小鼠气道上皮下纤维化这一气道重构现象，抑制Notch信号通路减轻善哮喘小鼠气道上皮下纤维化。

[关键词]Notch； 胶原蛋白； 哮喘； 上皮下纤维化

哮喘(asthma)是一种慢性病，属于常见病、多发病，但其发病机制非常复杂，目前对人类哮喘的认识停留在哮喘症状描述上，对哮喘发病机制的研究仍很有限，故而哮喘的防治仍停留在对症处理阶段，病因治疗难以突破。有关哮喘气道重塑的研究是目前研究的难点。气道上皮下纤维化是哮喘气道重塑的核心[1-2]。I型胶原(typeⅠ collagen, ColⅠ)是沉积于纤维化部位的细胞外基质的核心成分[3-4]。Notch信号通路是一种贯穿于细胞的生长、发育、凋亡等的保守的信号通路，多项研究表明Notch信号通路是否参与了心肌纤维化、肺纤维化、肾脏纤维化等疾病的发生、发展[5-6]。那么，Notch信号通路是否也能调控哮喘气道上皮下纤维化尚不清楚。本研究拟通过分子生物实验及动物实验来验证Notch信号通路是否参与了哮喘气道上皮下纤维化的调控，抑制Notch信号通路是否能抑制哮喘气道上皮下纤维化。

材料和方法

1动物和细胞

24只雄性SPF级BALB/c小鼠，6～8周龄，平均体重(18±2) g，购自第四军医大学实验动物中心。动物的管理及使用得到第四军医大学动物管理伦理委员会批准。

高表达Notch 胞内段(Notch intracellular domain,NICD)的小鼠气道成纤维细胞L929(L929-NICD)、对照细胞L929、高表达NICD的人气道成纤维细胞MRC-5(MRC-5-NICD)和对照细胞MRC-5均由本实验室留存。而空细胞L929以及空细胞MRC-5从中科院上海生科院细胞库获得。

2主要试剂

胎牛血清购于HyClone；培养基DMEM购于Gibco；胰酶、M-280 Dynabeads和山羊抗兔IgG(红色荧光)购于Invitrogen；Hes1兔多抗购于Santa Cruz；琼脂糖购于上海国药；山羊抗兔IgG(H+L)HRP购于Byeotime；细胞核蛋白提取试剂盒购于上海生工股份有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于Pierce；DNA多聚酶购于Promega；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京天根生化；ECL化学发光试剂盒购于Beyotime；GAPDH兔多抗购于华安生物；小鼠及人COL1A1(编码ColⅠ的α1链)和COL1A2(编码ColⅠ的α2链)基因的引物由上海生博合成；卵蛋白(OVA)购于Sigma；EVG染色试剂盒购于BASO；表达KyoT2的腺病毒载体及对照病毒由上海生博生物技术公司包装；ColⅠα1及ColⅠα2抗体购于Santa Cruz。

3主要方法

3.1生物信息学分析从http://www.genomatix.de数据库中查找小鼠及人的COL1A1和COL1A2基因，利用该数据库软件分析COL1A1和COL1A2启动子转录位点附近有无Hes1的结合位点，即N-box位点。

3.2DNA-pull down实验进行核蛋白抽提，先将L929空细胞、L929-NICD细胞、L929对照细胞、MRC-5空细胞、MRC-5-NICD细胞及MRC-5对照细胞按1×105接种于DMEM培养皿内，培养72 h，当细胞融合度达80%时收集细胞按照上海生工核蛋白抽提说明书进行操作获得这几组细胞核蛋白后，用BCA试剂盒操作说明进行BCA法蛋白定量获取蛋白浓度后留样作后续实验。分别将小鼠及人COL1A1和COL1A2 DNA作为模板，加入引物，进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，用紫外线分光光度仪测量浓度后，将这些扩增后的DNA按说明分别加入到Dynabeads M-280 Streptavidin 磁珠内，置摇床上室温清摇3 h，先后用洗涤缓冲液清洗磁珠2次，离心弃洗涤液，加入PBS重悬磁珠，将上述经定量的各细胞核蛋白提取物按照磁珠操作说明取样后分别加入5 μL鲑鱼精DNA，室温下置摇床轻摇15 min，遂加入到磁珠混合物中，混匀30 min。将各组细胞来源成分与磁珠的混合物置于磁珠架上固定磁珠，分别收集上清作内参照检测备用。用PBS清洗磁珠-COL1A1和COL1A2 DNA-核蛋白2次，再用洗脱液洗脱核蛋白，分别收集各组洗脱液用于目的蛋白Hes1的Western blot 检测。

3.3Western blot实验配制浓缩胶为5%，分离胶为10%， 插上上样梳子，待胶凝固后拔除梳子，将上述洗脱出来的目的蛋白及预留作为内参照用上清液上样，电泳时浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，当marker 各条带充分分离后电泳停止。以300 mA电流NC膜转1 h。将NC膜用5%脱脂奶粉-TBST液封闭1 h，将NC膜置于按1∶500稀释的Hes1抗体中室温孵育10 min后置于4 ℃冰箱继续孵育过夜后取出，室温孵育30 min，用TBST洗膜3 min 3次，取出NC膜置于用5%脱脂奶粉-TBST按1∶1 000稀释的山羊抗兔IgG(H+L)HRP液中，室温摇床轻摇40 min，取出NC膜用TBST洗3 min 6次。将NC膜转移至暗室，滴加ECL反应液，置于暗盒覆上X光胶片、关闭暗盒，曝光10 s后经显影、定影、清洗后晾干胶片，标上marker条带并分析。将每组细胞的NC膜沸水煮10 min，再经封闭后用GAPDH兔多抗作为I抗孵育洗涤后再用II抗山羊抗兔IgG(H+L)HRP孵育，最后经滴加ECL、显影、定影得到内参照的条带供分析。

3.4动物实验将BALB/c鼠随机分成4组(每组6只)：正常对照(control)组、哮喘(asthma)组、哮喘对照空载腺病毒干预(placebo)组和哮喘KyoT2腺病毒载体干预(target)组。Asthma组、placebo组及target组分别在第1天和第7天予腹腔注射0.2 mL卵清蛋白/氢氧化铝-PBS混悬液致敏，于第14天始将小鼠置于自制密闭玻璃容器内，用5%卵清蛋白生理盐水超声雾化吸入激发(每日1次，每次25 min，连续4周)，期中placebo组及target组分别在第8 天经鼻滴入空载腺病毒及载KyoT2腺病毒5×108pfu。而control组用同等量的PBS腹腔注射，雾化也均用PBS。上述4组小鼠最后一次雾化后72 h内处死，取肺组织10%甲醛固定48 h、石蜡包埋、切片留作染色用。

3.5免疫荧光染色将上述control和asthma组的小鼠肺组织切片经常规脱蜡、水化后用PBS液清洗3次，每次3 min后，先用枸橼酸钠缓冲液将肺组织抗原进行微波修复后，用动物非免疫血清封闭1 h，去除封闭液，加入ColⅠα1或ColⅠα2抗体，每张切片50 μL，室温静置1 h后放4 ℃冰箱孵育过夜。取出切片37 ℃复温40 min，PBS液清洗10 min 3次。除净PBS液，加入带红色荧光的山羊抗兔IgG, 避光室温下孵育1 h后再用PBS液清洗并用50 μL DAPI行核染色5 min，再PBS清洗后封片剂封片，荧光显微镜拍照观察。

3.6EVG染色将上述4组小鼠肺组织切片经常规脱蜡至水后按照操作规程用高锰酸钾氧化、蒸馏水洗、草酸漂白后再予蒸馏水清新，用95%乙醇清洗后浸入Elastin染液中24 h，再次用95%乙醇分化，并先后用自来水、蒸馏水清洗，最后用Van Gieson染液对比染色1 min，95%乙醇急速分化数秒，无水乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封固待干后显微镜下观察。

3.7气道上皮下纤维化的观察将上述经EVG染色后的小鼠肺组织切片置于显微镜下观察，每个切片在高倍镜下(×400)至少观察10个视野，找到完整的细支气管横断面，以细支气管为中心用NIS-Elements系统测量分析细支气管上皮下胶原纤维的厚度，每个小鼠随机测量6支细支气管，每组小鼠至少测量3只，最后计算平均厚度。

4统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，用单因素方差分析法进行分析(one-way ANOVA)，用最小显著性差异法(LSD法)进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1COL1A1及COL1A2启动子转录位点上游发现Hes1结合位点

生物信息学分析发现在人和小鼠I型胶原蛋白的2个亚型基因上存在Hes1蛋白的结合位点CACNAG, 这与我们过去的分析一致[7]，见图1。

Figure 1.Bioinformatic analysis showed there are Hes1 binding sites in human or mouse type I collagen promoters. The blue markers were the binding sites.

图1人和鼠I型胶原蛋白启动子生物信息学分析

2COL1A1及COL1A2基因探针沉淀出Hes1蛋白

本研究分别用小鼠及人COL1A1和COL1A2基因探针，从上调了Notch信号的人和鼠气道成纤维细胞中沉淀出了与之相结合的Hes1蛋白，反映了Hes1与COL1A1和COL1A2启动子存在相互作用,见图2。

3哮喘小鼠肺组织中ColⅠα1及ColⅠα2表达增多

哮喘模型小鼠及正常对照小鼠肺组织中均有ColⅠα1及ColⅠα2的表达，而且哮喘时肺组织中这2种蛋白表达明显高于正常对照组，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

Figure 2.The results of DNA-pull down and Western blot. A: type I collagen promoter genes pulled down the binding protein Hes1 in mouse airway fibroblasts (L929, L929-NICD and L929-control); B: type I collagen promoter genes pulled down the binding protein Hes1 in human airway fibroblasts (MRC-5， MRC-5-NICD and MRC-5-control).

图2DNA-pull down 和Western blot实验结果

Figure 3.The expression of ColⅠα1 (A) and ColⅠα2 (B) in the lung tissues of asthmatic mouse model observed by immunofluorescentce staining. Red is for collagen, while blue is for DAPI. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control.

图3免疫荧光染色观察哮喘模型组肺组织中ColⅠα1和ColⅠα2的表达

4KyoT2下调哮喘小鼠气道上皮下纤维化

哮喘模型小鼠经Notch抑制剂KyoT2腺病毒载体经鼻滴入后，观察肺组织切片气道上皮下纤维化的情况，发现相对于哮喘小鼠未处理组及哮喘空载病毒处理组，给予KyoT2腺病毒载体处理的哮喘小鼠肺组织内气道上皮下纤维化明显下降，差异有统计学显著性(P<0.01)，且其气道上皮下纤维化程度与正常小鼠组接近，见图4。这表明抑制Notch信号通路能改善哮喘小鼠气道上皮下纤维化。

Figure 4.Airway subepithelial fibrosis in the asthamtic mice (EVG staining,×40). Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs placebo.

图4肺组织EVG染色观察哮喘模型小鼠的肺组织细支气管上皮下胶原纤维增生和厚度变化以及Notch抑制剂KyoT2干预的影响

讨论

哮喘气道上皮下纤维化是哮喘气道重塑的核心事件，而气道上皮下纤维化的物质基础是胶原蛋白在气道上皮下的沉积。本研究首先通过对人和鼠I型胶原蛋白基因COL1A1和COL1A2启动子转录位点附近的生物学信息分析提示其上存在Notch下游关键分子Hes1结合位点CACNAG序列，即N-box结合位点。通过DNA-pull down实验证实用COL1A1和COL1A2基因为探针能沉淀出与之结合的Hes1蛋白，进一步验证了I型胶原蛋白基因转录可能受到Hes1蛋白的调控。本研究又通过建立哮喘小鼠模型，通过免疫荧光方法检测哮喘模型鼠及对照小鼠肺组织内ColⅠα1及ColⅠα2的表达，发现哮喘小鼠中前述2种蛋白的表达明显增多。进而用Notch信号通路抑制剂KyoT2腺病毒载体干预小鼠后行病理学观察发现哮喘小鼠肺组织内气道上皮下纤维化即胶原蛋白在气道上皮下的沉积明显较对照组减轻，因此我们认为Notch信号的确参与了哮喘气道上皮下纤维化这一气道重塑现象，而抑制Notch信号通路可以减轻气道重塑。本课题组过去在细胞水平的研究中曾发现，将NICD转染人和小鼠气道成纤维细胞时，这2种细胞ColⅠα1及ColⅠα2的表达增多，这与我们本研究中哮喘小鼠气道ColⅠα1及ColⅠα2的表达增多一致[7]。

目前的研究认为，Notch配体与受体结合后Notch信号通路即被启动，NICD释放，并最终与下游的蛋白效应器CSL(C-promoter binding factor-1/suppressor of hairless/LAG1)结合后募集MAML(mastermind-like family members)形成NICD-CSL-MAML三联复合物[8]，下游的关键因子Hes1等基因被启动，从而调控目的基因的表达最终影响细胞的生长、分化、增殖及凋亡。KyoT2通过与CSL相互作用而负性调节Notch信号[9]。最近的一些研究认为Notch信号通路可直接调控α-肌动蛋白基因启动子活性从而诱导肺成纤维细胞[10]、肾小管上皮细胞[11]及主动脉平滑肌细胞向肌纤维母细胞分化，并认为Notch信号对心肌的修复、皮肤的纤维化[12]、肝脏的纤维化[13]也均有影响。有研究也发现抑制Notch途径能改善慢性肾炎引起的肾纤维化[14-15]。但是另一项有关松弛肽抑制心肌细胞纤维化的研究却提示Notch信号通路抑制了胶原蛋白的合成[16]，这与本研究有差异，可能与Notch信号在不同脏器中的特异性调控有关，还需进一步研究。

总之，我们发现Notch信号通路在气道上皮下纤维化中有调控作用，抑制Notch信号通路途径能下调哮喘气道上皮下胶原蛋白的表达从而降低哮喘气道上皮下纤维化，Notch信号通路的抑制剂可能成为哮喘治疗的新药物，尤其是对那些以气道重塑为核心的难治性哮喘的治疗，Notch信号通路抑制剂的选择可能是治疗的新策略。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Notch signaling regulates airway subepithelial fibrosis in asthmatic mice

HU Mei1, 2, XU Xin-ting2, LI Hong-mei1, LI Shan-shan1, WU Chang-gui2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine, 306thHospitalofPLA,Beijing100101,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:changguinew@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of Notch signaling in regulating airway subepithelial fibrosis in the asthmatic mice.METHODS: The binding sites of Notch signaling molecules in type I collagen gene promoter were analyzed by bioinformatic methods. DNA-pull down assay and Western blot were further performed to verify Hes1 binding to type I collagen gene. The mouse asthmatic model was established and the type I collagen expression in the lung tissues were detected by immunofluorescence staining. To explore the Notch efficacy on asthmatic airway subepithelial fibrosis, mouse asthmatic model was intranasally administered recombinant adenovirus vectors containing KyoT2. Then the airway subepithelial fibrosis of asthmatic mouse model was evaluated by EVG staining.RESULTS: The results of bioinformatic analysis showed that Hes1 binding to type I collagen gene near to its transcription site was observed. The results of DNA-pull down assay and Western blot confirmed this binding. The expression of type I collagen in the asthmatic mice was higher than that in the normal mice (P<0.05). Furthermore, EVG staining showed more severe airway subepithelial fibrosis in the asthmatic model than that in the control (P<0.01). CONCLUSION: Notch signaling has great efficiency in regulating airway subepithelial fibrosis in asthmatic mouse model, and the Notch signaling repressor down-regulates airway subepithelial fibrosis in the asthmatic mice.

[KEY WORDS]Notch; Collagen; Asthma; Subepithelial fibrosis

[文章编号]1000- 4718(2016)05- 0781- 06

[收稿日期]2015- 09- 08[修回日期] 2016- 03- 09

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81170020)

通讯作者△Tel: 029-84775233; E-mail: changguinew@126.com

[中图分类号]R363.2

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.002

杂志网址： http://www.cjpp.net

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