siRNA沉默EGLN1基因对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞生长的影响*

孙　莉，　嘎　琴，　杨全余，　靳国恩

(青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001)



siRNA沉默EGLN1基因对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞生长的影响*

孙莉，嘎琴，杨全余，靳国恩△

(青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001)

[摘要]目的： 体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)，利用小干扰RNA技术转染PASMCs干扰EGLN1基因表达，检测细胞活力变化，从而验证EGLN1在PASMCs活力变化中的作用。方法: 采用原代培养PASMCs，构建出特异的EGLN1 siRNA脂质体并转染到PASMCs；分别在常氧和低氧下进行细胞培养，采用Western blot 检测PASMCs 的EGLN1蛋白、VEGF蛋白表达水平；用CCK-8法检测细胞活力，探讨低氧条件下沉默EGLN1基因表达后对PASMCs活力的影响。结果: 低氧下PASMCs活力变化和VEGF的蛋白水平表达较常氧下增加并呈时间依赖性;EGLN1沉默后，无论低氧和常氧下，PASMCs活力变化和VEGF的蛋白水平表达均受到抑制。结论: EGLN1基因参与调控低氧下大鼠PASMCs的生长，其调节可能是通过VEGF的介导而完成的。

[关键词]低氧； EGLN1基因； 大鼠肺动脉平滑肌细胞； 细胞活力

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是高原地区常见病、不同年龄段均可发病，其主要病理特征为肺动脉压的持续增高和肺动脉壁的增厚及血管肌性化，严重时可诱发右心结构和功能改变，甚至出现心力衰竭而危及生命。其中低氧是该病发生的最主要因素。肺动脉血管收缩性增加、肺血管重构及微血管损伤是HPH的主要病理机制[1]，前者主要发生在低氧早期，具有可逆性，后者出现在低氧后期，其可逆性差。其中肺血管重塑主要表现为肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)肥大、增生和细胞外基质合成增多导致肺小动脉管壁变厚，内径变窄，肌型血管中膜肥厚，非肌型血管出现平滑肌样细胞等。因此，低氧性肺血管重构是慢性低氧性肺动脉高压的基础，低氧性肺血管重构的防治研究日益受到人们的重视。

EGLN1基因编码的脯氨酸羟化酶2(proline hydroxylase 2，PHD2)是重要的低氧反应元件和高海拔低氧环境功能适应的主要氧感受器。其作为低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)信号通路中的重要调节因子，低氧下PHD2羟基化HIF-1α受阻，蛋白质的降解中断，HIF-1α亚基大量累积，启动多种低氧反应基因的转录从而诱导靶基因表达，形成低氧反应调节通路，参与调节高海拔低氧适应过程。当前研究发现，与缺氧有关的2 个基因EPAS1(HIF-2α)和EGLN1在西藏夏尔巴人中强表达，这2个基因与非藏族的低海拔地区(汉族与日本人)明显不同[2-4]。虽然国内外在研究HIF-1α对PASMCs的影响方面的报道很多，但有关EGLN1是否也参与了低氧下对肺动脉平滑肌细胞活力的调控尚未见报道。

由于，EGLN1对于PASMCs生长与肺血管重建的作用并不明确， 本研究主要研究干扰EGLN1 基因的表达, 是否影响其下游低氧应答反应的激活, 最终调节一系列如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等下游低氧应答基因的表达，使得机体适应高海拔低氧环境。因此，本实验利用siRNA技术，体外转染PASMCs并干扰EGLN1的表达，检测细胞活力变化，探讨EGLN1在PASMCs生长中的作用。

材料和方法

1主要试剂

胎牛血清和OPTI-MEM购于Gibco；DMEM/F12购于HyClone；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液和青、链霉素混合液(100×)购于Solarbio；Lipo2000购于Invitrogen；DAPI和FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)购于碧云天生物技术公司；蛋白预染Marker购于Fermentas；BCA蛋白定量试剂盒购于Thermo；吐温-20(Tween-20)购于Amresco；NC膜购于Millipore；EGLN1、VEGF和α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗体购于Abcam；GAPDH抗体购于CST；CCK-8购于七海生物。

2方法

2.1大鼠PASMCs的分离、培养及鉴定取SD大鼠超净台内处死，取肺组织，分离肺内动脉血管于PBS中。分离出血管中膜，轻刮内膜面3～5次，PBS漂洗1次，置于含20%胎牛血清和1%双抗的D/F12培养液中。用眼科剪将血管中膜剪碎(1 mm2左右)，将碎片移到培养瓶底均匀排布，加入足量的DMEM/F12，倒置培养箱中孵育4～6 h后，另一侧翻转培养瓶使培养液没过组织块。在培养箱中孵育3～7 d后进行观察和换液，镜下观察细胞已融合生长即可传代培养。传代培养时，吸去培养液和漂浮的组织块，用PBS漂洗培养瓶2～3次，胰蛋白酶(0.25%)消化3 min，使细胞脱落后离心。取细胞悬液，置于培养皿中继续培养，培养箱中孵育。传代时，将细胞悬液静置，使部分细胞(成纤维细胞和内皮细胞)贴壁，然后将未贴壁的细胞转移至另一培养皿中，再次静置、贴壁，重复2次即可得到较纯的平滑肌细胞。

将细胞培养液洗去，细胞爬片用0.02 mol/L PBS洗涤3次，用4 %甲醛固定30 min，0.02 mol/L PBS洗5 min 3次。滴加合适比例稀释的I抗，4 ℃下孵育过夜。PBS漂洗5 min 3次，不时振荡洗去多余游离抗体。滴加合适比例稀释的荧光II抗，4 ℃下孵育1 h。防淬灭封片剂封片，荧光显微镜下拍片。

2.2siRNA细胞转染及靶点筛选转染对照组：250 μL Opti-mem无血清培养基；阴性对照(negative control,NC)组：将5 μL NCsiRNA(约100 pmol)溶于245 μL Opti-mem无血清培养基中；阳性对照(postive control,PC)组：将5 μL PCsiRNA溶于245 μL Opti-mem无血清培养基中；干扰组：将5 μL siRNA溶于245 μL Opti-mem无血清培养基中；每组加入5 μL的lipo2000及245 μL Opti-mem无血清培养基混合溶液，室温静置20 min。转染时弃去原培养基，用无菌PBS漂洗 1 次，再加入1 mL不含血清培养液。把各管复合物缓缓加入相应的培养液中，摇匀，37 ℃培养箱中放置6 h，吸除无血清转染液，换入完全培养液继续培养。转染后用Western blot检测siEGLN1的3个靶点的表达。EGLN1基因3个siRNA oligo序列如下：靶点1为5’-AUGGAGACGGAAGAUGUGUUU-3’(348～370)；靶点2为5’-GACGGAAGAUGUGUGACAUUU-3’(353～375)；靶点3为5’-GCGGAGGUAUUCUUCGAAUUU-3’(411～433)。

2.3低氧条件下培养PASMCs并检测干扰效果空白组只有培养基无PASMCs；阴性对照组(非干扰组)即在培养基中加入PASMCs；干扰组为siRNA干扰EGLN1后的PASMCs加入培养基中。采用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液 的DMEM/F12培养液，常氧培养置于37 ℃、5% CO2、20% O2的培养箱(Thermo Forma 3111)中进行培养，低氧培养置于37 ℃、5% CO2、2% O2的培养箱(Thermo Forma 3131)中培养。台盼蓝染色活细胞率达95%以上。在常氧和低氧条件下分别培养0 h、24 h、48 h、72 h。72 h后用Western blot法检测siRNA的干扰效果。

2.4Western blot法检测VEGF蛋白的表达水平Western blot法检测VEGF蛋白表达，提取细胞总蛋白，取20 μg蛋白样品于10% SDS-PAGE分离并转膜。膜在室温下封闭1 h，分别加入I 抗(EGLN1为1∶1 000、GAPDH为1∶1 000)及HRP标记的 II 抗孵育。ECL化学发光显影，以目的蛋白与 GAPDH灰度比为表达值，取 3次结果的平均值作为相对密度值。

2.5CCK-8法检测EGLN1对低氧条件下PASMCs细胞活力的影响将转染48 h的细胞胰蛋白酶消化，稀释细胞使其浓度为3×107/L培养液。分别取100 μL至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，每孔3×103个细胞，常氧培养过夜贴壁。在常氧和低氧条件下分别培养0 h、24 h、48 h、72 h后，按1∶10 体积比混合CCK-8和无血清基本培养基DMEM/F12，每孔100 μL加入待测孔中，37 ℃、5% CO2孵育1 h；用微板分光光度计测定450 nm波长下的吸光度(A)值，记录每块板的数值。

3统计学处理

采用 SPSS 16.0统计软件，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析进行组间差异比较，两两比较分别采用SNK-q法、Tamhane’s T2法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1PASMCs细胞形态学鉴定

原代培养3 d，可见PASMCs贴壁伸展，形态各样，大小不一，三角形、梭形、带状或不规则型的都有，胞浆丰富。部分区域多层重叠生长，高低起伏，细胞多的地方叠在一起，形成一个山峰，细胞少的地方一个都没有，呈现“峰-谷”状，是PASMCs的典型生长特点。应用免疫荧光的方法对PASMCs进行鉴定，荧光显微镜下可见，绿色荧光标记的α-SMA，见图1。

Figure 1.The immunofluorescence staining of α-SMA in primary cultured rat PASMCs. 1: primary cell culture (×100); 2: α-SMA (×200); 3: DAPI (×200); 4: merge (×200).

图1大鼠PASMCs原代培养及其免疫荧光鉴定结果

2EGLN1 siRNA靶点筛选

Western blot检测结果显示，EGLN1的3个靶点经干扰沉默后， 靶点2、3干扰沉默后EGLN1蛋白表达均明显受到抑制(P<0.05)，其中干扰靶点3的效果最好，见图2。

Figure 2.The expression of EGLN1 was interfered by the various interference targets determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs interference control.

图2Western blot检测各干扰靶点EGLN1的表达量

3低氧后检测干扰效果

低氧分组培养72 h后，常氧下和低氧下的siEGLN1组都有较好的干扰效果(P<0.05)。常氧下阴性对照组EGLN1的表达较与低氧下阴性对照组低(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The protein expression of EGLN1 under the condition of normoxia or hypoxia for 72 h determined by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs normoxia control;*P<0.05 vs hypoxia control.

图3Western blot检测分组培养72 h后的EGLN1干扰效果

4Western blot法检测VEGF蛋白的表达水平

当低氧培养48 h和72 h时，无论对照组还是干扰组与常氧下相比，VEGF的表达均有所升高。常氧干扰组和低氧干扰组VEGF的表达与相应的对照组均有所减少。各组的VEGF表达均随培养时间有所增加，但常氧组增加并不明显，仅少数组有统计学差异，而低氧组VEGF增加更明显，见图4、表1。

Figure 4.Western blot determined the protein expression of VEGF.

图4Western blot法检测VEGF蛋白的表达水平

其中，我们在分别培养72 h后检测各组EGLN1和VEGF的蛋白表达， 由图5可见，低氧下各组EGLN1与VEGF的表达较常氧下表达均有所增加，2个干扰组的EGLN1受到抑制时，各干扰组相对其对照组的VEGF表达均降低。

Figure 5.Western blot determined the protein expression of EGLN1 and VEGF.

图5Western blot检测培养72 h后各组EGLN1和VEGF的蛋白表达

表1　各组VEGF/GAPDH相对表达量的比较

*P<0.05 vs negative control;#P<0.05 vs normoxia group;△P<0.05 vs 24 h group;◆P<0.05 vs 48 h group.

5CCK-8法检测EGLN1对低氧下PASMCs细胞活力的影响

CCK-8法检测细胞活力情况，结果显示出各组的吸光度值均随时间增强，其中低氧对照组增强最明显，低氧干扰组和常氧对照组次之，常氧干扰组最弱。由表2可知，因为空白组除培养基外并无肺动脉平滑肌细胞，空白组在低氧与常氧下无差异。各组在0 h时吸光度无差异。无论在常氧或低氧情况下，对照组和空白组与干扰组相比差异均有统计学显著性(P<0.05)。在常氧和低氧情况下，干扰组的细胞活力与对照组相比均减弱(P<0.05)。对照组和干扰组在低氧培养下细胞活力与常氧组比均有所增强(P<0.05)。

表2　CCK-8法测量不同分组下PASMCs细胞活力情况

△P<0.05 vs 0 h group;*P<0.05 vs 24 h group;#P<0.05 vs 48 h group;◆P<0.05 vs normoxia group;▲P<0.05 vs control group.

讨论

低氧性肺血管重建是HPH的主要病理变化，包括肌型动脉中膜平滑肌增殖肥大、非肌型动脉肌化内膜增厚以及外膜成纤维细胞增殖，其中位于血管壁中膜的PASMCs在增殖中起主要作用，是导致HPH的重要环节，而细胞活力的变化能从侧面说明细胞增殖情况。对于低氧性HPH研究显示，低氧促进了PASMCs的异常增殖，PASMCs低氧性增殖在肺血管重建中起重要作用[5]，这与本研究的研究结果相符。EGLN1(PHD2)是在人体内普遍存在的Fe2+和2-同戊二酸依赖的加氧酶超家族成员, 对HIF-1α的调节起关键作用, 是HIF-1α降解反应的限速酶[6-8]。近年来的研究表明,发现EGLN1与藏族的高原适应性有关。其中，EGLN1 基因在高海拔低氧环境适应的人群中存在很强的正选择, 它是欧亚(包括藏族)和安第斯人群共同的与高海拔低氧环境适应相关的基因[9-11]。VEGF是HIF-1α介导的下游转录基因，而VEGF与肺血管通透性、血管生成以及血管结构重构密切相关。因此，本研究用转染法将外源siRNA掺入到肺平滑肌细胞而获得新的遗传标志的过程来构建EGLN1干扰模型。在经过体外转染PASMCs并做筛选后，选定转染效率最好的靶点3，采用Western blot实验来检查转染结果，结果显示干扰后的EGLN1表达显著降低，说明转染模型构建成功。低氧下，EGLN1的表达量增加，VEGF表达增高，PASMCs活力较常氧下有明显增高，并具有时间依赖性，这与罗颖等[12]的研究结果一致。而EGLN1siRNA作用后，EGLN1的表达受到抑制的同时，VEGF的表达相比未干扰组有所下降，这与Fisher等[13]的研究结果一致。此外，研究结果也显示EGLN1对PASMCs活力可能具有一定的增强作用，低氧下PASMCs细胞活力较常氧下增加。当EGLN1受到抑制时，VEGF的表达和细胞活力变化均受抑制。EGLN1能够促进对机体PASMCs活力增强及肺血管重建，但该基因的过度表达对非低氧适应性动物并不起保护作用。而也有研究显示PHD-2敲除后增加细胞HIF-1α水平和导致增加VEGF等下游血管生成因子的转录[14]。因此，低氧下，EGLN1是如何调控VEGF的表达来影响肺平滑肌细胞生长的尚需要进一步证明。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effects of EGLN1 siRNA on growth of rat pulmonary artery smooth muscle cells under hypoxic condition

SUN Li, GA Qin, YANG Quan-yu, JIN Guo-en

(ResearchCenterofHigh-AltitudeMedicine,QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:jmcy2005_teacher@aliyun.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe whether EGLN1 gene is involved in the growth of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) during hypoxia when EGLN1 gene expression was interference by siRNA. METHODS: The rat primary pulmonary arterial smooth muscle cells were cultured, and the specific lipidosome of EGLN1 siRNA was constructed and transfected into the PASMCs. The transfected PASMCs were cultured under hypoxia or normoxia conditions, respectively. The viability of the PASMCs was detected by CCK-8 assay. The protein expression of EGLN1 and vascular endothelial growth factor (VEGF) was determined by Western blot. RESULTS: The viability of the PASMCs was increased and the protein expression of VEGF was up-regulated in the PASMCs under hypoxic condition in a time-dependent manner. In hypoxia or normoxia condition, the viability and VEGF protein expression of the PASMCs were suppressed by EGLN1 siRNA. CONCLUSION: EGLN1 gene may involve in the growth of rat PASMCs by regulating VEGF protein level under hypoxic condition.

[KEY WORDS]Hypoxia; EGLN1 gene; Rat pulmonary arterial smooth muscle cells; Cell viability

[文章编号]1000- 4718(2016)05- 0787- 05

[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81160243)； 人社部留学人员科技活动项目([2011]518号); 青海省重点实验室发展专项(No. 2014-Z-Y-30)

通讯作者△Tel: 0971-8172252； E-mail: jmcy2005_teacher@aliyun.com

[中图分类号]R332； R363.2

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.003

杂志网址： http://www.cjpp.net