不同组方加味藿香正气软胶囊对脂多糖诱导小鼠原代骨髓巨噬细胞炎症相关因子表达的影响＊

王红梅，吕耀中，刘莉娜，周建明，许治良，周 军，王振中，萧 伟

（1.江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

不同组方加味藿香正气软胶囊对脂多糖诱导小鼠原代骨髓巨噬细胞炎症相关因子表达的影响＊

王红梅1,2＊＊，吕耀中1,2＊＊，刘莉娜1,2，周建明1,2，许治良1,2，周 军1,2，王振中1,2，萧 伟1＊＊＊

（1.江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

本研究考察不同组方加味藿香正气软胶囊对脂多糖诱导小鼠原代骨髓巨噬细胞炎症相关因子表达的影响。采用原代小鼠骨髓单核细胞用M-CSF诱导成骨髓巨噬细胞，经鉴定后，用脂多糖（LPS）诱导其产生各种炎症因子（TNF-a、IL-6、IL-12p40，NO），加入不同组方的加味藿香正气软胶囊，收集上清检测各种炎症因子含量。结果显示，原代小鼠骨髓细胞单核细胞经诱导成成熟巨噬细胞，LPS（1 μg·mL-1）能刺激其产生炎症因子，不同组方加味藿香正气软胶囊均能一定程度降低LPS诱导的炎症因子的释放，尤其是苍术代替白术后效果更明显。不同组方藿香正气软胶囊均可降低LPS刺激的炎症因子的产生，减轻其炎症反应，可能是加味藿香正气软胶囊治疗肠道炎症的重要机制之一。

加味藿香正气软胶囊 脂多糖 巨噬细胞

炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）和克罗恩病（Crohn’s Disease，CD），是一种病因尚不明确的非特异性肠道炎症性疾病，临床表现为腹痛、腹泻、黏液血便，甚至出现一些全身并发症。目前西药治疗IBD的主要药物，如氨基水杨酸类和糖皮质激素类药物，以缓解症状为主，毒副作用大、容易复发；而中药治疗IBD具有标本兼治，不易产生耐药和毒副作用的特点，受到越来越多的关注。因此，从传统中药中寻找IBD治疗药物具有十分重要的意义。加味藿香正气软胶囊源于宋代官方太医局主持编写的《太平惠民合剂局方》卷之二治伤寒，是由藿香正气散改剂型而来，具有解表化湿、理气和中等功用，主治外感风寒、内伤湿滞证、头痛、恶寒、发热、胸脘满闷、脘腹疼痛、霍乱、呕恶泻痢、舌苔白腻，以及山岚瘴疟。研究表明，藿香正气方具有镇痛、止泻、抗菌和调节免疫功能等多方面的作用[1-4]。另有研究显示，感染性腹泻都会伴随细胞炎症因子的升高[5]，但是藿香正气类药物组方中对于白术（苍术）、制半夏（生半夏）、生姜（干姜）的用药不统一，本文以藿香正气软胶囊为基方，对其中三味药材进行改变组合后考察不同组方对LPS刺激原代骨髓巨噬细胞炎症相关因子表达的影响，以期找到对炎症抑制较好的组方，并为其在胃肠道疾病治疗中提供实验依据。

1 材料

1.1 药物

组分1是以加味藿香正气软胶囊为基方，组方为白术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、半夏（制）、生姜、甘草、桔梗、大枣，其中桔梗和大枣为新加入，组分2是以苍术代替白术，组方3是以生半夏、干姜代替半夏（制）、生姜，组方4是以苍术、生半夏、干姜代替白术、半夏（制）、生姜组合方。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要实验仪器

SW-CJ-2F超净工作台（苏净安泰公司），Thermo 3100二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），CKX41SF倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），96孔细胞培养板（美国Costar公司），75 cm2细胞培养瓶（美国Costar公司），Infinite M200 PRO酶标仪（瑞士Tecan公司），移液枪（德国Eppendorf公司），BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），LD4-2A离心机（北京众益中和生物技术有限公司），c1028细胞自动计数仪（美国Invitrogen公司）；Bio-Plex 200系统（美国Bio-Rad公司）；流式细胞仪（美国Millipore公司）；FlexStation 3多功能钙流工作站（美国Molecular Devices公司）。

1.2.2 主要实验试剂

DMEM培养基（美国Gibco公司，批号：8113041）、进口胎牛血清（美国Gibco公司，批号：608759）；红细胞裂解液（自制，8.29 g NH4CL，1.00 g KHCO3，37.2mg Na2EDTA溶于1 000 mL蒸馏水中，pH=7.2-7.4，过滤除菌后备用）；重组小鼠M-CSF、内毒素脂多糖（Lipopolysacchrides，LPS）（美国Sigma公司，批号分别是：0809AFC245、L2880）、瑞氏染液（美国Sigma公司，批号：BCBH7694V）；抗小鼠CD11b（APC）、F4/80（Alexa Fluor 488）（美国Life Technologies公司，批号分别是：729130B、1386817A）；CCK-8试剂盒（上海贝博生物公司，批号：BB130041）；NO检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，产品编号：S0021）；多因子检测试剂盒（美国BIO-RAD公司，批号：5036298）。

1.3 动物

Balb/c小鼠，雌雄不限，体重18-20 g，6-8周龄。

2 方法

2.1 药物提取制备

各味药材分别进行前处理、粉碎成粗粉，按各自处方用量称取处方用药材，混合均匀，用8倍量95%乙醇提取2次，第一次2 h，第二次1 h，过滤合并乙醇提取液，备用；药渣用8倍量水提取2次，第一次2 h，第二次1 h，过滤合并水提取液，备用，乙醇提取液70℃减压回收溶剂至适量（无醇味），合并水提取液；80℃减压浓缩、干燥、粉碎，即得各组方粗提物，备用。

2.2 小鼠原代骨髓巨噬细胞获取

据文献方法[6]略作改进，以颈椎脱臼法处死小鼠，经75%乙醇（体积分数）消毒后解剖，取出股骨及胫骨，去净肌肉及结缔组织，乙醇消毒一次，剪掉骨两端，用1 mL注射器吸取DMEM培养基冲出骨髓，直至骨发白，重复以上步骤至收集足够量的骨髓，轻轻吹散细胞，以250g离心5 min收集细胞，用2 mL红细胞裂解液重悬以裂解红细胞，1 min 后立即加入20 mL DMEM，充分混匀，过200目细胞筛，再以250 g离心5 min，弃上清，沉淀用PBS重悬清洗细胞两次，用10% FBS DMEM培养基重悬细胞接种至培养瓶，常规培养2 h后收集悬浮细胞，用1 mL含M-CSF（20 μg·L-1）的DMEM 完全培养基（含1%双抗和10% FBS）重悬细胞，计数。按1×106个/mL细胞接种于铺有鼠尾胶原的6孔板，每孔2 mL。以含M-CSF的DMEM 完全培养基培养7天，隔天半量换液一次。

2.3 骨髓巨噬细胞收集及鉴定

2.3.1 骨髓细胞培养形态学观察

获取小鼠骨髓细胞并用M-CSF诱导后，分别于第3、5、7天光镜下观察细胞形态。

2.3.2 骨髓巨噬细胞瑞氏染色鉴定

收集骨髓巨噬细胞并计数后，将细胞接种至加有无菌盖玻片的6孔板，以含M-CSF的DMEM完全培养基培养7天，隔天半量换液一次，7天后取出盖玻片晾干，加入瑞氏染液染色30 min后倒置显微镜下观察细胞情况并拍照。

2.3.3 骨髓巨噬细胞表面细胞标记鉴定

收集诱导后骨髓巨噬细胞并计数后，按1×106个/mL分装至EP管中，分成正常组、CD11b组、F4/80组、CD11b+F4/80组，各组250g离心5 min，弃上清，用PBS（含1%BSA）洗细胞一次，分别按分组加入流式抗体室温避光染色20 min，离心弃上清，用PBS（含1%BSA）洗细胞一次去除多余抗体，流式细胞仪检测各种巨噬细胞的比例。

2.4 细胞增殖活性的检测

调整收集诱导后的巨噬细胞悬液密度为4×105个/mL，按每孔100 μL接种至96孔培养板，置37℃，5 % CO2，饱和湿度孵箱培养24 h，吸除旧培养液，分别设置空白组、组方1组、组方2组、组方3组、组方4组共5组，除空白组外，每组加入终浓度为50 μg·mL-1的相应组方药物，每组均设置4个复孔，继续培养24 h，提前4 h加入10 μL/孔 CCK-8溶液，继续培养4 h，于450 nm处检测各孔的吸光度。实验重复至少3次。

2.5 NO、TNF-α、IL-6、IL-12p40的检测

调整收集诱导后的巨噬细胞悬液密度为4×105个/mL，按每孔100 μL接种至96孔培养板，置37℃，5% CO2，饱和湿度孵箱培养24 h，吸除旧培养液，分别设置空白组、LPS组、LPS+组方1组、LPS+组方2组、LPS+组方3组、LPS+组方4组，每组使LPS终浓度为1 μg·mL-1，药物终浓度50 μg·mL-1，每组均设置3个复孔，继续培养24 h，采用NO检测试剂盒，检测细胞上清液中NO稳定氧化代谢产物亚硝酸盐（NO2-）水平，吸取上清50 μL加入到96孔板，按照NO试剂盒说明书加入相应试剂，540 nm处用钙流工作站测定各孔吸光度，根据所获吸光度值在其标准曲线上查取NO；采用多因子检测试剂盒检测TNF-α、IL-6、IL-12p40分泌量，取细胞培养上清参照试剂盒说明书，Bio-Plex 200系统检测各孔数值；其标准曲线计算TNF-α、IL-12p40、IL-6的相应浓度。

2.6 统计学处理

3 实验结果

3.1 诱导小鼠骨髓单核细胞向巨噬细胞分化

图1 巨噬细胞培养7天形态及流式细胞仪检测

获取小鼠骨髓细胞并用M-CSF诱导后，第3天细胞开始出现聚集，5天时聚集增多，细胞出现巨噬细胞形态特征，7天时光镜和瑞氏染色均发现细胞呈现巨噬细胞的典型形态（图1、2）。并于诱导后第7天流式细胞仪检测巨噬细胞的分化情况时发现有相当数量的细胞分化具有CD11b和F4/80双阳性的特征（图3）。综上所述，小鼠骨髓来源的巨噬细胞培养成功。

3.2 HXZQ药物对细胞增殖活性的影响

各药物在50 μg·mL-1时对原代诱导骨髓巨噬细胞生长无影响，各组与正常对照相比均无统计学差异（见图2）。

图2 4种组方药物对巨噬细胞增殖的影响

3.3 HXZQ药物对LPS诱导原代骨髓巨噬细胞释放NO、IL-6、TNF-α、IL-12p40的影响

经LPS刺激后各种炎症因子均有显著升高，炎症模型复制成功；加药后各组方对LPS刺激巨噬细胞产生炎症因子中IL-6和IL-12p40有显著的抑制作用，与LPS组有显著性差异，而组方1并能抑制TNF-α含量升高，但对于NO释放无统计学差异；组方2能抑制TNF-α、NO含量升高与LPS组有统计学差异；组方3对TNF-α含量无统计学差异，但可以抑制NO含量升高，与LPS有统计学差异；而组方4对TNF-α、NO含量升高均能抑制，与LPS组有显著性差异。综上所述，各组方对LPS刺激巨噬细胞炎症因子的释放均有一定程度的抑制，其中以组方4效果最佳（见图3）。

图3 4种组方药物对LPS诱导的巨噬细胞产生炎症因子的影响

4 讨论

脂多糖是介导系统性炎症反应综合症的主要启动因子。它可激活单核细胞、巨噬细胞，引起细胞因子的合成和释放，导致机体的一系列炎症反应。在正常情况下，静止的巨噬细胞仅产生极少量的NO、TNF-α、IL-6，当巨噬细胞受炎症等激活后会产生大量的NO和TNF-α，并进一步诱导IL-6等炎性因子的产生[7]，LPS刺激细胞后，各种炎症因子均有较高表达。本研究的实验结果与文献结果相符。

本文采用LPS诱导骨髓原代巨噬细胞释放炎症因子作为体外研究模型，针对不同组方的藿香正气软胶囊对LPS诱导骨髓原代巨噬细胞释放NO、IL-6、TNF-α、IL-12p40等炎症因子的抑制作用进行了初步研究。结果表明，不同组方藿香正气软胶囊均能不同程度抑制LPS诱导骨髓巨噬细胞分泌炎症因子，其中组方2以苍术代替白术后，提高了对炎症因子的抑制作用。苍术和白术中均含有白术内酯I和白术内酯Ⅲ，为其抗炎的主要有效成分[8-9]，该类成分能调节炎症因子的表达，可能与它们作用于TLR4受体有关[10]。但是，苍术代替白术后提高抗炎作用的机制尚不清楚，有待进一步研究。组方3以生半夏、干姜代替半夏（制）、生姜后除抑制TNF-α含量作用稍有不同外，其余指标未见明显改善，文献报道中制半夏较生半夏除保留了其抗炎作用，且化痰作用增强并降低了其部分刺激性毒性[11]；组方4效果略优于其他组方，能显著抑制各种炎症因子的分泌，是因为苍术、生半夏、干姜3种药材联合作用的效果。本文中样品采用不同批次相同方法提取后用于实验，并实验重复至少3次以降低中成药粗制剂杂质所带来的样品成分的不稳定性，本课题组对不同组方加味藿香正气软胶囊共多个类方进行了其对DSS致小鼠溃疡性肠炎的影响实验，初步结果显示不同组方对疾病活动指数、结肠长度及病理指标上有不同程度的改善作用，由此可以证明加味藿香正气软胶囊有一定程度的抗炎作用，但加味藿香正气软胶囊在通路中具体的调节机制还需进一步研究。

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Different Formulas of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule on Expression of Inflammatory Factors Induced by Lipopolysaccharide in Primary Murine Bone Marrow Macrophages

Wang Hongmei1,2, Lv Yaozhong1,2, Liu Lina1,2, Zhou Jianming1,2, Xu Zhiliang1,2, Zhou Jun1,2, Wang Zhenzhong1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical, Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001 China)

This study was aimed to investigate the effects of different formulas ofJiawei Huoxiang Zhengqi(JWHXZQ) soft capsule on expression of inflammatory factors induced by lipopolysaccharide (LPS) in the primary murine bone marrow macrophages. Murine bone marrow PBMCs were induced into macrophages by M-CSF. The bone marrow macrophages were confirmed and induced by LPS to release inflammatory cytokines (TNF-a, IL-6, IL-12p40 and NO). Extracts from different formulas of JWHXZQ soft capsule were added. The cell culture supernatants were collected to detect the contents of inflammatory cytokines. The results showed that LPS (1 μg·mL-1) stimulated the releasing of inflammatory cytokines from the mature monocyte macrophages. The levels of inflammatory cytokines were significantly reduced in the LPS induced cell treated with the extracts from different formulas of JWHXZQ soft capsule, especially in the formula whichBaishuwas replaced byCangshu.The formulas of different HXZQ soft capsule could reduce the release of inflammatory cytokines stimulated by LPS, which may be one of the important mechanisms of JWHXZQ soft capsule in treatment of inflammatory bowel diseases.

Jiawei Huoxiang Zhengqisoft capsule, lipopolysaccharide, macrophage

10.11842/wst.2016.03.023

R283

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2014-12-25

修回日期：2015-04-02

＊ 科学技术部国际科技合作专项（2013DFA31090）：中药治疗胃肠道炎性疾病药效评价体系建立，负责人：王振中。

＊＊ 王红梅和吕耀中为共同第一作者。

＊＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，博士，研究员级高级工程师，主要研究方向：中药新药的研究与开发。