反复心肌缺血致心肌梗死模型的制备＊

魏 芸，严素玉，张彩峰，张硕峰

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

反复心肌缺血致心肌梗死模型的制备＊

魏 芸，严素玉，张彩峰，张硕峰＊＊

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

目的：本研究通过大鼠反复心肌缺血并叠加冠状动脉结扎手术建立反复心肌缺血至心肌梗死模型。方法：通过大鼠尾静脉反复缓慢推注垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血，叠加冠状动脉左前降支结扎手术建立大鼠反复心肌缺血致心肌梗死模型。以心电图、生化指标[肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及心肌梗死范围]为指标，确定最佳造模条件。以通心络胶囊为阳性药，以生化指标肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及心肌梗死范围为指标验证该模型用于评价中药治疗心肌缺血的可行性。结果：垂体后叶素15 U·kg-1给药后与7.5 U·kg-1比较大鼠心肌缺血出现所需时间较短，心肌缺血持续时间均可稳定在20 min以上，与30 U·kg-1比较动物死亡率低；垂体后叶素给药3天，心肌缺血持续时间均可稳定在30 min以上，与假手术组比较心肌酶显著升高，动物死亡率低。通心络胶囊组与模型组比较心肌梗死体积显著减小（P＜0.05）、血清酶LDH、CK-MB、ALT活性值明显降低（P＜0.05）。结论：大鼠尾静脉推注垂体后叶素15 U·kg-1，反复给药3天为最佳造模条件。大鼠反复心肌缺血致心肌梗死模型适于评价中药的抗心肌缺血作用。

大鼠 反复心肌缺血 心电图 垂体后叶素

心肌缺血是心脏的血液灌注减少，从而导致心脏供氧减少，心肌能量代谢异常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态，是世界范围普遍的疾病[1-3]，心肌缺血进一步发展将导致冠心病、心肌梗死等一系列心血管类疾病,这类疾病在发展中国家和发达国家有很高的发病率和死亡率[4,5]。抗心肌缺血药物的研究是目前医学研究的热点，而建立可靠的动物模是药物研究的基础。型目前评价药物抗心肌缺血作用的动物模型大致可分为以下几类：急性心肌缺血模型[6-8]、慢性心肌缺血模型[9]、可控性心肌缺血模型[10]。慢性心肌缺血模型造模时间长，成本高昂；可控性心肌缺血模型虽具有与人类的发病机制与病程发展相近似的优点，但操作难度大，需要专门的设备和技术支持；急性心肌缺血模型具有操作简单，成模时间短的优点，是最常用的动物模型，但此种方法的治疗时间窗短，与临床中药防治心肌缺血使用情况不符，为使中药在抗心肌缺血领域的早期预防、早期治疗的优势作用得到体现，本研究模拟临床病人心肌缺血反复发作，最终发展为心肌梗塞的病理过程，建立了大鼠反复心肌缺血致心肌梗死模型，为抗心肌缺血中药的研发提供一种符合临床中药使用特点的可靠的研究方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠100只，雌雄各半，体质量180-200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为SYXK（京）2011-0024。

1.1.2 药品与试剂

垂体后叶素注射液，规格6 U/2 mL（上海第一生化药业有限公司，批号：130702）；红四氮唑TTC（北京化工厂，批号 0140402）；肌酸激酶同工酶（南京建成生物工程研究所，批号20150427）；乳酸脱氢酶（南京建成生物工程研究所，批号20150413）；丙氨酸氨基转移酶（南京建成生物工程研究所，批号20150413）；天冬氨酸氨基转移酶（南京建成生物工程研究所，批号20150425）；试通心络胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，批号A1405019）。

1.1.3 主要仪器

JS-B微量注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）；RM6240C多通道生理采集系统（成都仪器厂）；DW3000呼吸机（安徽正华生物仪器设备有限公司）；GL-21高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；UV-2000型紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）有限公司]；HZQ-C空气浴振荡器（哈尔滨市东明医疗仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 反复心肌缺血至心肌梗死模型条件的确定

1.2.1.1 垂体后叶素尾静脉推注最佳给药剂量的选择

①分组

取30只大鼠随机分为3组，垂体后叶素用量分别为：7.5、15.0、30.0 U·kg-1。

②造模方法

腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（37 mg·kg-1）麻醉大鼠，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图；使用微量注射泵以0.167 mL·min-1速度分别经尾静脉缓慢推注垂体后叶素7.5、15、30 U·kg-1（约6 min），根据心电图观察给药结束后大鼠心肌缺血出现时间、心肌缺血持续时间以确定最佳给药剂量。大鼠心电图出现以下各项作为心肌缺血的诊断标准[11]：T波高耸，超过同导联R波1/2；ST段上抬或下移＞0.1 mV；T波高耸伴有ST段移位；P波消失；T波倒置。心肌缺血持续时间的计算以下移ST段、倒置T波、上抬ST段三者之一恢复至初始值50%的时间为准。

1.2.1.2 垂体后叶素最佳给药次数的选择

①分组

取SD大鼠50只随机分为5组：垂体后叶素组（给药1、2、3、4天）、假手术组。

②造模方法

垂体后叶素各组按“1.2.1.1”的参数尾静脉推注垂体后叶素15 U·kg-1，每天1次，分别注射1、2、3、4天，最后一次注射垂体后叶素时记录大鼠标准Ⅱ导联心电图，采集大鼠心肌缺血出现时间、心肌缺血持续时间、恶性心律失常出现例数（包括室性早搏、心房扑动）。24 h后，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（37 mg·kg-1）麻醉大鼠，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图；经口气管插管，连接动物呼吸机（呼吸频率60 次/min，潮气量6 mL），于左侧第四肋间开胸，用6/0丝线在肺动脉圆锥和左心耳交界下缘1-2 mm 结扎，以结扎部分紫绀和心电图ST段抬升作为结扎成功的标志。手术后观察10 min，挤出胸腔内空气并逐层关胸，恢复大鼠自主呼吸，拔出气管插管并清除气管内分泌物，回笼饲养。

③指标检测

造模24 h后，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（37 mg·kg-1）麻醉大鼠，腹主动脉取血，并迅速取出心脏，置冰冷生理盐水中冲洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌组织，置于-20℃冰箱放置10 min。在心脏结扎线下，平行冠状沟将心脏自心尖至心底部横切成4-5 片（厚约1.5-2 mm），置于1% TTC磷酸盐缓冲液中（pH 7.4）于37℃空气浴中孵育10 min。将染色后的心脏切片置于4%多聚甲醛溶液中固定，扫描心脏切片的正反两面，用Image-Pro Plus 7.0C 软件测量每片心脏切片及梗死部位的面积，并计算心室体积及梗死体积，梗死范围以梗死体积占全心室体积的百分比表示。血液于3 000 rpm 离心15 min（4℃），得到血清样品，冻于-80℃冰箱备用，以测定血清心肌酶谱检测包括肌酸激酶（CK）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性。

1.2.2 通心络胶囊对大鼠反复心肌缺血至心肌梗死模型的影响

1.2.2.1 分组及给药

SD大鼠30只随机分为3组：模型组、通心络胶囊组、假手术组。通心络胶囊组自造模开始第一天起每天灌胃给予通心络胶囊2次（每次160 mg·kg-1），给药容积1 mL/100 g体重，连续给药3天，于结扎冠状动脉脉前30 min灌胃给药一次，结扎后6 h再灌胃给药一次。假手术组、模型组灌胃给予等量饮用水，给药容积1 mL/100 g体重。

1.2.2.2 造模方法

按“1.2.1.1”的参数尾静脉缓慢推注垂体后叶素15 U·kg-1，每日一次，共3次，第4天腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（37 mg·kg-1）麻醉大鼠结扎左冠脉左前降支。假手术组尾静脉缓慢推生理盐水，在冠状动脉左前降支相应位置穿针而不打结，其余操作与模型组一致。

1.2.2.3 指标检测

计算大鼠心肌梗死体积、检测血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）酶活性。

1.2.3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示。组间均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 反复心肌缺血至心肌梗死模型条件的确定

2.1.1 垂体后叶素尾静脉推注最佳给药剂量的选择

结果显示随着垂体后叶素剂量的增加，大鼠出现心肌缺血的潜伏期越短，心肌缺血持续的时间越长。其中垂体后叶素30 U·kg-1给药后立刻出现心肌缺血，持续时间超过60 min，并导致部分动物死亡；垂体后叶素7.5 U·kg-1给药后心肌缺血持续时间较短；垂体后叶素15 U·kg-1给药后心肌缺血出现所需时间较短，心肌缺血持续时间均可稳定在20 min以上。故认为尾静脉推注垂体后叶素15 U·kg-1为最佳剂量。详见表1。

表1 不同剂量垂体后叶素静脉注射对大鼠心肌缺血程度的影响

表1 不同剂量垂体后叶素静脉注射对大鼠心肌缺血程度的影响

2.1.2 垂体后叶素最佳给药次数的选择

结果显示，大鼠尾静脉推注垂体后叶素15 U·kg-1，随着给药次数的增加，大鼠心肌缺血出现的潜伏期愈来愈短，心肌缺血持续时间愈来愈长，给药3次以上，心肌缺血持续时间均可稳定在30 min以上；给药4次时，80.0%的动物出现恶性心律失常，并有30.0%的动物死亡；结扎冠状动脉前降支后各组动物均出现心肌梗死，且梗塞范围接近，血清心肌酶亦有不同程度的升高（与假手术组比较P＜0.05），其中反复给药3天，心肌酶升高幅度较小。故垂体后叶素15 U·kg-1反复给药3天为最佳造模条件。详见表2-表4。

表2 垂体后叶素15 u·kg-1多次静脉注射给药对大鼠心电图的影响

表2 垂体后叶素15 u·kg-1多次静脉注射给药对大鼠心电图的影响

注：*恶性心律失常包括室性早搏、心房扑动。

2.2 通心络胶囊对大鼠反复心肌缺血至心肌梗死模型的影响

结果显示，大鼠尾静脉推注垂体后叶素15 U·kg-1，反复给药3天并结扎冠状动脉前降支后各组动物均出现心肌梗死，血清CK-MB、ALT、LDH活性显著升高（与假手术组比较P＜0.05）。通心络胶囊可使心肌梗死范围明显减少，大鼠血清CK-MB、LDH、ALT活性均显著降低（与模型组比较P＜0.05）。详见表5-表6。

3 讨论与结论

垂体后叶素是从动物脑垂体后叶提取的一种水溶性物质，垂体后叶素包含血管加压素和缩宫素两种活性成分[11]，大剂量的垂体后叶素可引起冠状动脉、毛细血管、小动脉及小静脉痉挛性的收缩，导致心脏灌流不足，耗氧量明显增加，造成心肌缺血、缺氧[12,13]。注射垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型被广泛用于抗心肌缺血药物的筛选和评价[14]。本研究采用反复静脉给与垂体后叶素15 U·kg-13天致大鼠反复心肌缺血的方法，并加以中药进行干预，模拟临床患者长期心肌缺血的病理过程和使用中药的治疗过程；结合结扎大鼠左冠脉左前降支方法致心肌梗死，模拟临床患者长期心肌缺血发展为心肌梗死的病理过程，并以心肌梗死范围、心肌酶作为中药干预作用的评价指标建立动物模型,为抗心肌缺血中药的研发提供一种符合中药临床用药特点的动物模型。

通心络胶囊是根据中医络病学理论研制而成的中药复方制剂，由人参、土鳖虫、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、降香、赤芍、冰片等药物组成，具有通络活血、缓急止痛及益气养阴之功效[15]。临床用于冠心病心绞痛，研究证实其治疗冠心病心绞痛的临床有效性及心电图有效性与目前临床常用的硝酸酯类药物相当[16]。故本研究选用通心络胶囊来验证该模型用于评价中药治疗心肌缺血的可行性。

研究结果表明显示，通心络胶囊治疗给药4天后可使心肌梗死范围减少29.5%，大鼠血清CKMB、LDH、ALT活性亦显著降低，表明通心络胶囊可明显减轻缺血对心肌造成的损伤。

综上所述大鼠反复心肌缺血至心肌梗死模型操作简便、能够充分体现中药早期预防、早期治疗的特点，适于评价中药抗心肌缺血的作用。

表3 大鼠垂体后叶素15 U·kg-1多次静脉注射给药并结扎左冠脉左前降支后对心脏梗死范围的影响/%

表3 大鼠垂体后叶素15 U·kg-1多次静脉注射给药并结扎左冠脉左前降支后对心脏梗死范围的影响/%

注：与假手术组比较，**P＜0.01。

表4 大鼠垂体后叶素15 U·kg-1多次静脉注射给药并结扎左冠脉左前降支后对血清酶活性的影响/U·L-1

表4 大鼠垂体后叶素15 U·kg-1多次静脉注射给药并结扎左冠脉左前降支后对血清酶活性的影响/U·L-1

注：与假手术组比较，*P＜0.05。

表5 通心络胶囊对反复心肌缺血至心肌梗死模型大鼠心肌梗死范围影响

表5 通心络胶囊对反复心肌缺血至心肌梗死模型大鼠心肌梗死范围影响

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与反复模型组比较，#P＜0.05。

表6 通心络胶囊对反复心肌缺血至心肌梗死模型大鼠血清酶活性的影响

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与反复模型组比较，#P＜0.05。

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Research on Method of Repeated Myocardial Ischemia to Myocardial Infarction Model in Rats

Wei Yun, Yan Suyu, Zhang Caifeng, Zhang Shuofeng
(School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to confirm model of the repeated myocardial ischemia to myocardial infarction model in rats. The model was induced by injecting vasopressin repeatedly via the tail vein slowly for several days. And then, the left anterior descending coronary artery was ligated. The electrocardiogram (ECG), biochemical indicators (CK-MB, AST, ALT) and the myocardial infarction volume were taken as indexes for the determination of optimized conditions for the model. Tongxinluo (TXL) capsule was chosen as positive drug. Biochemical indicators, including CK-MB, LDH, ALT, and the myocardial infarction volume were used to evaluate the feasibility of Chinese medicine in anti-ischemic treatment of the new model. The results showed that in the appear time of myocardial ischemia the vasopressin 15 U·kg-1group was significantly lower than the vasopressin 7.5 U·kg-1group. The duration of myocardial ischemia was more than 20 min. The mortality rate of rats was lower compared to the vasopressin 30 U·kg-1group. After 3-day vasopressin, the duration of myocardial ischemia was more than 30 min. Compared with the sham operation group CK-MB was significantly increased with low mortality rate of rats. The myocardial infarction volume of TXL capsule group was significantly decreased compared with the model group (P＜ 0.05). The activities of serum enzymes (LDH, CK-MB and ALT) were significantly lower than model group (P＜ 0.05). It was concluded that the optimal model establishment condition was to inject 15 U·kg-1of vasopressin via the tail vein repeatedly for three days. The model of repeated myocardial ischemia to myocardial infarction model was adapted to evaluate the anti-ischemic effect of Chinese medicine.

Rat, repeated myocardial ischemia, ECG, vasopressin

10.11842/wst.2016.03.017

R318.11

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：王 晶）

2016-01-12

修回日期：2016-01-27

＊ 科技部十二五重大新药创制（2012ZX09103201-036）：三七和红花有效组分复方配伍的候选药物研究，负责人：姜勇。

＊＊ 通讯作者：张硕峰，副教授，主要研究方向：中药防治心血管研究。