基于1H-NMR技术探讨艾灸与针刺对血清代谢物的调节作用＊

钟 欢，佘 畅，呙安林，汪厚莲，葛君芸，刘 密，刘迈兰，吴璐一，常小荣＊＊，吴焕淦＊＊

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院 长沙 410007；2.上海中医药大学上海市针灸经络研究所 上海 200030）

基于1H-NMR技术探讨艾灸与针刺对血清代谢物的调节作用＊

钟 欢1，佘 畅1，呙安林1，汪厚莲1，葛君芸1，刘 密1，刘迈兰1，吴璐一2，常小荣1＊＊，吴焕淦2＊＊

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院 长沙 410007；2.上海中医药大学上海市针灸经络研究所 上海 200030）

目的：基于核磁共振氢谱代谢组学技术（1H-NMR）探讨艾灸与针刺对健康青年志愿者血清代谢物调节作用的差异性，从代谢物层面揭示两者的作用特点及差异。方法：将60例健康青年男性志愿者随机分为艾灸组与针刺组，每组各30例，艾灸组采用温和灸作用于右侧足三里穴，每天1次，每次15 min，连续干预10天；针刺组采用不锈钢针针刺右侧足三里穴，每天1次，每次15 min，连续干预10天。两组在干预0、5、10天清晨采集受试者血清，利用1H-NMR技术对血清代谢物进行检测。结果：干预0、5天时艾灸组与针刺组的代谢模式无显著性差异；干预10天时艾灸组与针刺组的代谢模式可显著区分；艾灸与针刺干预5天后血清中表现出差异的代谢物有Creatine和Glycine（P＜0.05；P＜0.01）；干预10天后血清中表现出差异的代谢物有LDL/VLDL、Valine、Isoleucine、Leucine、Lactate、Glutamine、Creatine、Glucose（P＜0.01）和Glycine（P＜0.05）；随着干预时间的变化，艾灸与针刺对血清代谢物的调节作用有差异。结论：艾灸与针刺右侧足三里对血清代谢物有明显的调节作用，随着干预时间的变化，两者的调节作用发生变化。

艾灸 针刺 代谢组学 差异

针灸是“针刺”和“艾灸”的合称，两者是中医针灸学科中两种不同的治疗方法[1]。艾灸是借助灸火的热力对人体的特定穴位进行刺激，以达到治病、防病目的，该方法具有温通经络、行气活血、祛湿逐寒、消肿散结、回阳救逆及防病保健的作用[2]。针刺是利用金属制成的针具，通过一定的手法，刺入人体特定穴位，从而调节机体的方法，具有调和阴阳、扶正祛邪、疏通经络、行气活血等作用[3]。“针”、“灸”同属于中医外治疗法，虽然两者有着相同的经络腧穴理论基础，却有着各自的临床适应症。揭示两者作用机制的差异，为临床特异性选择治疗手段提供科学依据，是针灸学科中亟待解决的科学问题。目前，相关研究从神经、免疫等方面探讨了两者之间的差异，多从细胞、炎性因子、关键蛋白表达等方面进行[4-6]，且学者多认为艾灸在调节免疫系统病症方面要优于针刺，而针刺在神经系统病症或疼痛类疾病方面疗效优于艾灸。然而，对两者差异进行系统研究的报道较少。代谢组学技术是系统生物学的研究方法，具有动态性、完全性、整体性的特点，与针灸作用于人体的特点十分吻合，代谢组学能灵敏的反映体内小分子代谢物的变化，从代谢物层面系统地揭示刺激对生物体代谢的影响。因此，本研究采用1H-NMR代谢组学技术从代谢物角度探讨了艾灸与针刺对人体血清代谢物的差异性调节作用，从代谢物层面揭示了两者的作用特点及差异。

1 方法

1.1 基础资料

本研究中的60例男性志愿者均来自湖南中医药大学，利用随机数字表随机分到艾灸组或针刺组，干预过程中脱落8例，其中艾灸组2例、针刺组6例。

1.2 针刺、艾灸方法

试验过程中嘱咐志愿者避免剧烈运动，艾灸组连续10天于同一时间段（18:00-19:00）对志愿者右侧足三里穴（ST36）进行艾灸，艾灸由课题组中经培训的专业人员操作，艾灸时距离皮肤2-3 cm，以志愿者有感觉（热、酸、麻、胀、痛）且能耐受为度；针刺组连续10天于同一时间段（18:00-19:00）对志愿者右侧足三里穴（ST36）进行针刺，针刺由本课题组经过专业培训的人员进行操作，针刺时快速刺入皮肤30 mm左右，行捻转、提插手法15 s，以志愿者有感觉（酸、麻、胀、痛）且能耐受为度；艾灸组与针刺组操作空间为两个相邻的独立房间。

1.3 样品收集

采血前一天21:00至取样前禁止饮食，采血前24 h禁食咖啡、巧克力和茶等含有咖啡因的饮料或食物，两组志愿者均于试验开始的0、5、10天的同一时间段（07:00-08:00）在校医院由专业护士采血，试管为无任何添加剂的干燥管，常温凝集后置于低温离心机中以3 000 r·min-1离心10 min，控制采血至离心时间为2 h以内，离心后移液枪取上层血清，-80℃保存待测。

1.4 样品预处理

将保存于-80℃的血清样品解冻后离心（10 000 rpm，4℃，10 min）。选取无溶血的待测样品，取300 μL血清，加入200 μL由D2O制备的PBS（0.6 mol·L-1K2HPO4和NaH2PO4），离心后加入5 mm的核磁管。

1.5 核磁共振谱的采集及数据处理

血清核磁共振一维氢谱由Bruker AV600 Ⅲ核磁共振谱仪采集。一维CPMG谱采用的脉冲序列为cpmgpr1d [RD-90°-（τ-180°-τ）n-acq]（ Bruker Biospin pulse program library），过滤掉大分子和其他限制分子运动的信号。自旋回波中的τ设为500 μs，循环次数n设为20，因此总自旋回波时间为20 ms，为消除来自蛋白质等大分子量物质的宽包信号，在弛豫等待时间（RD）内进行预饱和水峰压制。谱图的采样数据点（TD）为64 K，谱宽（SW）为20 ppm，累加次数（NS）为128次，空采次数（DS）为16次。

用MestReNova 6.1软件对NMR谱进行基线和相位校正，谱峰对齐，定标，以0.002 ppm对0.2-9.5 ppm区域进行分段积分，剔除因压制水峰而畸变的区域。将化学位移δ4.52-6.00处的积分设为0，对剩余积分值进行归一化处理。用NMR Suite软件结合已发表的化合物化学位移数据，指认代谢物的共振信号。

NMR谱分段积分后用SIMCA软件处理，先进行非监督的PCA分析，确认样品的分类情况，去除极端点，识别代谢模式变化趋势；然后对数据进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）及其模型验证，证明分类的正确性；再运用有监督的OPLS-DA方法对模型进行正交矫正处理，最大化地凸显模型内部不同组别的差异，寻找对区分代谢模式有显著贡献的重要代谢物。在PLS-DA分析中使用7倍交叉验证方法，采用200次循环的排列实验验证所建立的判别模型的鲁棒性（Robustness），并通过分析相关系数和结合变量权重重要性排序值，对有统计意义的变量（Bin）进行归纳，找出存在显著差异的特异性代谢物。

1.6 统计方法

采用独立样本t检验和单因素方差分析（ANOVA）检验组间代谢物浓度的差异。用各组样品代谢物的积分值计算代谢物的相对浓度，数据用表示。P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 艾灸与针刺对血清代谢模式的影响

艾灸与针刺干预10天后两组志愿者血清代谢模式有显著差异，通过主成分分析方法对艾灸组与针刺组干预前两组血清代谢模式进行分析，结果（见图1）显示干预前两者血清代谢模式不能区分，说明干预前两者血清代谢模式一致。艾灸、针刺干预5天后血清代谢模式同样不可区分，结果（见图2）说明艾灸与针刺5天时两者血清代谢模式一致，艾灸与针刺对血清代谢模式的影响没有显著差异。而艾灸、针刺10天后两者血清代谢模式可显著区分，结果（见图3）说明艾灸、针刺干预10天对两者血清代谢模式的影响较大，两者有显著差异，进一步通过OPLS-DA对PLS-DA模型进行矫正处理，最大化地突显两者代谢模式的差异后得出差异性代谢物谱图，图3。

图1 艾灸与针刺干预前两者血清代谢模式图

2.2 艾灸与针刺后血清代谢物浓度的变化

艾灸与针刺对血清代谢物浓度的影响有较大的差异，两者对志愿者干预5天后表现出差异的代谢物有Creatine和Glycine（P＜0.05；P＜0.01）。干预10天后血清中表现出差异的代谢物有低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白（LDL/VLDL）、缬氨酸Valine、异亮氨酸Isoleucine、亮氨酸Leucine、乳酸Lactate、谷氨酸Glutamine、肌氨酸Creatine、葡萄糖Glucose（P＜0.01）和甘氨酸Glycine（P＜0.05），不同时间的艾灸与针刺干预后血清中代谢物浓度见表1。

2.3 艾灸与针刺后血清代谢物浓度的变化趋势

艾灸与针刺过程中血清差异性代谢物浓度随干预时间长短的变化较大，艾灸在干预过程中5天时上调且10天时下调的代谢物有Creatine、Glycine、Glucose、Valine、Glutamine、Leucine、Isoleucine；5天时下调且10天时上调的代谢物有LDL/VLDL、Lactate。针刺过程中5天时上调且10天时下调的代谢物有LDL/VLDL；5天时下调且10天时上调的代谢物有Creatine；5天时下调且10天时也下调的代谢物有Glycine、Lactate；5天时上调且10天时也上调的代谢物有Glucose、Valine、Glutamine、Leucine、Isoleucine。总体来说，艾灸与针刺右侧足三里对代谢物浓度的调节作用在5天与10天时调节趋势不同，但艾灸10天时较针刺表现出更强的调节作用。另外，值得说明的是针刺对Lactate的调节作用在5天与10天时没有出现调节趋势不同而呈现一致变化趋势。

图2 艾灸与针刺干预5天后两者血清代谢模式图

艾灸与针刺对代谢物浓度调节作用的差异表现在对LDL/VLDL、Creatine、Glycine三者浓度变化的调节作用相反，而对Glucose、Valine、Glutamine、Leucine、Isoleucine的调节作用一致，但10天时艾灸的调节作用更显著。见图4。

3 讨论

代谢组学是系统生物学的一种研究方法，能在代谢物水平全面反映生物体在受外界刺激后的反应[7]。代谢组学的优势是整体的反映代谢物的特征性变化，可用于复杂系统的研究[8]。代谢组学在动态性、完全性、整体性的特点与针灸对人体的作用特点十分吻合。因此将代谢组学应用于针灸的研究将有益于揭示针灸的作用机制[9]。有研究运用代谢组学对针灸治疗神经退行性病变[10]、急性痛风性关节炎[11]、功能性消化不良[12]等的机制做过探讨，这些研究认为针灸治疗疾病可通过对代谢物的调节使机体的代谢模式向正常模式改善。因此，从代谢物的调节作用入手进行研究，可为揭示艾灸与针刺的作用机制差异提供科学依据。

图3 艾灸与针刺干预10天后两者血清代谢模式图及两者差异性代谢物谱图

表1 艾灸与针刺干预前后差异代谢物浓度

表1 艾灸与针刺干预前后差异代谢物浓度

注：与艾灸组同一时间点比较▲P＜0.05，与艾灸组同一时间点比较▲▲P＜0.01。

图4 艾灸与针刺对血清代谢物浓度随干预时间的影响，艾灸组与针刺组比较*P＜0.05，艾灸组与针刺组比较**P＜0.01。

本研究采用1H-NMR方法系统研究了艾灸与针刺对人体血清代谢物的调节作用，从结果中可看出干预5天时两者血清中有差异的代谢物有2个但不足以引起两者代谢模式的差异，干预10天后血清中代谢物浓度有显著差异的有9个，且能显著引起艾灸组与针刺组两者的血清代谢模式差异。干预10天的差异性代谢物中，艾灸与针刺对代谢物的调节作用既表现出相同的调节作用也表现出相反的调节作用，在相同的调节作用中艾灸干预引起的代谢物变化与针刺也表现出差异，即艾灸能更大程度的引起代谢物浓度的变化。

差异性代谢物中LDL/VLDL的变化反映了艾灸与针刺对血清中脂质代谢的调节作用[13]，而代谢物浓度在两组中相反的变化趋势表明：艾灸与针刺对脂质代谢的调节作用相反。针刺10天时引起LDL/ VLDL的降低可能预示着针刺在降低高低密度脂蛋白血症方面有优势，临床研究也曾证实了针刺在治疗高脂血症时的疗效[14]。艾灸与针刺对 肌酸的调节也呈现出相反的调节作用，干预10天后艾灸组肌酸浓度显著降低而针刺组浓度显著升高，以往研究显示，肌酸主要存在于骨骼肌，既可以内生也可外源性获取，肌酸及其磷酸化形式被认为是肌纤维能量代谢的关键中间体，外源性增加肌酸的摄入可有效的增加肌肉力量和耐力[15]，在没有外源性供给的情况下血清中肌酸水平的下降可被认为是动员到骨骼肌纤维进行能量代谢，这也可能预示着艾灸在增强肌肉能量代谢上有较明显的优势。

艾灸与针刺对差异性代谢物中缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸调节作用一致。第5天，艾灸组与针刺组中3种代谢物浓度均升高，两组之间无显著差异；10天后，两组的3种代谢物浓度有显著差异，艾灸组明显低于针刺组，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸三者称为支链氨基酸，属于必须氨基酸[16-18]。相关研究表明，脂肪组织有异化循环支链氨基酸和协同调节脂肪组织支链氨基酸酶的作用，从而能够调节循环支链氨基酸的水平[19]。另有研究表明，支链氨基酸则能促进骨骼肌合成，加快肌蛋白的合成代谢[20]。血清中支链氨基酸浓度的降低可能与骨骼肌合成相关，而升高可能与促进脂肪组织的代谢相关。因此，艾灸也可能更快的达到促进肌肉合成，调节脂肪组织代谢的作用。艾灸与针刺对差异性代谢物中谷氨酰胺的调节作用相似，均于5天时显著升高，而在10天时降低，且艾灸作用强于针刺作用，谷氨酰胺是体内含量最丰富的非必需氨基酸，是合成蛋白质、氨基酸、核酸和许多物质的前体物质[21]，在肝、肾、小肠和骨骼肌代谢中起到重要的调节作用，且有研究证实其能促进肌细胞生长[22]，并能参与谷胱甘肽和合成从而起到抗氧化作用，重要的是谷氨酰胺可在病理状态下有效的起到肠道黏膜的保护、促进黏膜修复等作用[23]。因此，艾灸、针刺足三里后均能对肠道功能进行调节，艾灸作用较针刺更加迅速。

综上所述，艾灸与针刺对志愿者血清代谢物有调节作用，且两者表现出一定的差异，艾灸更倾向于对骨骼肌能量代谢、合成代谢的调节，针刺更倾向于对脂质代谢的调节，两者均能对血清支链氨基酸、谷氨酰胺等进行调节，但艾灸有较针刺更迅速的调节作用。

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1H-NMR Metabonomics Reveal Difference of Metabolites between Moxibustion and Acupuncture on Young Volunteers

Zhong Huan1, She Chang1, Guo Anlin1, Wang Houlian1, Ge Junyun1, Liu Mi1, Liu Mailan1, Wu Luyi2, Chang Xiaorong1, Wu Huangan2
(1. College of Acu-Moxibustion, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. Shanghai Institute of Acupuncture Moxibustion and Meridian, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China)

This study was aimed to reveal the differences of metabolites between moxibustion and acupuncture on serum based on1H-NMR. A total of 60 healthy young male volunteers were randomly divided into the moxibustion group and the acupuncture group, with 30 cases in each group. In the moxibustion group, the treatment was mild moxibustion on the right “Zusanli” point for 15 minutes, once a day for 10 days. In the acupuncture group, acupuncture was used on the right “Zusanli” point for 15 minutes, once a day for 10 days. Serum was collected on the morning of 0-day, 5-day, and 10-day. The result showed that there was no significant difference on the metabonomic pattern on the 0-day and 5-day between the moxibustion group and the acupuncture group. After 10-day intervention, there were significant changes on the metabonomic pattern between the moxibustion group and the acupuncture group. After 5-day intervention, 2 metabolites changed significantly (creatine and glycine) (P＜0.05,P＜0.01). After 10-day intervention, 9 metabolites changed significantly (LDL/VLDL, valine, isoleucine, leucine, lactate, glutamine, creatine and glucose (P＜0.01), and glycine (P＜0.05). It was concluded that moxibustion and acupuncture had obvious adjustment to the metabolites, along with the treatment time indicated the regulation function changed.

Moxibustion, acupuncture, metabonomics, difference

10.11842/wst.2016.03.012

R245

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 科学技术部国家重点基础研究发展计划“973计划”项目（2015CB554502）：艾灸与针刺作用特点、效应响应异同的基础与临床研究，负责人：常小荣；国家自然科学基金委面上项目（81574082）：基于COX-2及相关信号通路研究针灸对慢性萎缩性胃炎大鼠的胃黏膜保护机制，负责人：刘密；高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题（20124323120002）：基于TFF/PAR介导的ERK信号转导途径研究艾灸促进胃黏膜损伤修复的作用机制，负责人：刘密；湖南省教育厅湖南省优秀博士学位论文获奖作者科研资助项目（YB2013B037）：合募配穴艾灸对胃黏膜损伤修复过程中三叶因子的调节作用，负责人：刘密；湖南省教育厅资助科研项目（14B129）：基于下丘脑弓状核-外侧隔核Ghrelin通路研究针灸对糖尿病大鼠胃运动的调节机制，负责人：刘密；湖南省教育厅湖南省研究生科研创新项目（CX2015B320）：基于代谢组学方法探讨针刺与艾灸对刺激点的局部作用机制，负责人：钟欢。

＊＊ 通讯作者：常小荣，二级教授，博士生导师，主要研究方向：针灸经络及针灸治病机制的研究；吴焕淦，本刊编委，二级教授，博士生导师，主要研究方向：针灸作用的基本原理与应用规律研究。