猪病检测新技术与未来趋势大家谈

专家观点

猪病检测新技术与未来趋势大家谈

本刊编辑/张金辉

猪病检测是指兽医及其他技术人员通过临床检查、应用先进的仪器设备及实验室检查等方法及早确诊猪病，减少损失。随着猪病的流行趋势越来越复杂，大家对猪病检测技术的关注度日益提高，相关的检测技术也是层出不穷。那么，目前猪场中普遍采用哪些检测技术、又有哪些新的检测技术、未来如何发展等一系列问题，我们非常荣幸邀请到行业内的专家、教授共同探究，从专业角度分享有关猪病检测的专业知识及应用经验、新技术开发等，以期为大家提供一些帮助。

特邀嘉宾：（排名不分先后）

左玉柱（河北农业大学动物医学院 预防兽医系主任）

曲向阳（环山集团养殖事业部兽医总监）

王艳丰（河南农业职业学院动物疫病快速诊断中心主任）

焦连国（大北农动物医学研究中心技术总监）

陶明华（上海海利生物技术股份有限公司技术服务经理）

左玉柱主任

曲向阳兽医总监

王艳丰主任

焦连国技术总监

陶明华技术服务经理

1 目前，在规模猪场常见的猪病检测方法有哪些？存在哪些不足？

王艳丰：目前，猪场的常见病主要是传染病和寄生虫病，尤以前者最为严重。因此，实验室检测的重点主要是猪传染病。猪传染病分为细菌性传染病和病毒性传染病，细菌性疾病的实验室检测方法主要有涂片镜检、分离培养、生化试验、动物试验、血清型鉴定及药敏试验等，属于传统的实验室检测方法，操作繁琐，需要的时间长。病毒性疾病检测常用方法主要有3种：一是胶体金检测卡试纸条，如猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病等，分为抗原检测卡和抗体检测卡，检测所需时间短，但其敏感性较低，且检测结果只能提供阳性、弱阳性、阴性的半定量结果，无法提供数值性的检测结果。因此，该方法目前只能作为初筛诊断试剂，用于疾病的辅助诊断。同时，也无法区分是疫苗抗体还是野毒抗体；二是抗体（抗原）检测ELISA试剂盒，目前，常用的猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪口蹄疫等，既有国产的，也有进口的，操作方便，检测结果快，但需要酶标仪，并且抗体ELISA检测试剂盒，除猪伪狂犬病等少数试剂盒外，其他大多无法区分疫苗抗体和野毒抗体，往往需要根据抗体水平升高的幅度和抗体离散度、临床表现等来进行判断，并且有些国产试剂盒与进口试剂盒检测结果存在一定差异。三是PCR检测方法，科研院所、大专院校及部分畜牧局系统应用较多，检测结果准确，但需要配套仪器，如PCR基因扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统等，投入费用高，操作条件要求高，需要专业人士才能操作。其他，如血凝试验、中和试验、凝集试验及琼脂扩散试验等，要么操作复杂、技术要求高，需要昂贵仪器，需要一定条件的实验室才能开展，要么特异性较低，也不适合大批量样品的检测。

焦连国：目前在规模化猪场常见的猪病检测方法有：1）ELISA方法：根据检测对象不同设计了直接法、间接法、夹心法等不同类型的ELISA方法。ELISA是目前检测抗体最常用与应用最广泛的方法。其面临挑战有：①敏感性有待提高，特别是检测抗原；②临床标准不统一，缺乏具有公信力的产品评价机构；③检测结果与金标准还有一定差距，例如：抗体检测是IgG抗体，而与中和抗体并不完全一致。2）免疫荧光方法：其应用较广的是采集扁桃体检测猪瘟病毒，由于试剂与专业人员等的限制，目前应用较少。3）基因检测技术：包括PCR、RT-PCR及基因测序等技术。基因检测技术是目前抗原检测中最主要的技术，基因测序的应用，便于区分疫苗毒与野毒，进一步提高了其应用价值。基因检测技术的不足：①结果阳性不代表临床发病，还需要与剖检、生产相结合，科学评估；②标准不统一，没有行业标准，假阳性或假阴性可能导致误判；③取样不合理，盲目下结论，不同检测机构检测结果差异大。4）细菌分离与药敏试验：目前实验室细菌分离与药敏试验开展不多，需要专业化实验室真正分离出致病性细菌并进行鉴定和增菌，最后筛选出敏感性药物。5）其他检测技术：胶体金、乳胶凝集、间接血凝等。其具有操作简单、不需要特殊设备等特点，而在基层有一定应用，但由于其敏感性和特异性的不足，多应用于初步判断。

曲向阳：目前我公司诊断实验室的传染病诊断方法依然以病原学检测与血清学检测为主。显微病理诊断有待建立。

1）病原分离：虽然病原分离与鉴定相对耗时，但依然是很多疾病诊断的“黄金标准”。但很多规模化猪场诊断实验室尚未开展此工作，或虽具备病原菌（或病毒）分离的设备条件，但在生产中实践应用的较少。目前环山集团养猪事业部诊断实验室已掌握了常见细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等）的分离与鉴定方法。可进一步进行药敏试验，可疑病原菌的血清型鉴定、毒力评价等，丰富了病原菌库，也极大地提高了临床诊治的效率。但因劳动量限制，目前我们通常不依照科赫法则（Koch postulates）对所分离细菌进行致病性回归验证（感染的病原菌有时并不具备致病性）。明年我们将新建细胞间，届时我们将开展感染病毒的分离与鉴定工作。

2）分子生物学诊断：目前以常规的PCR诊断为主。操作便捷，也可较快地获知结果。但样品选择、试剂盒是否标准化及实验室交叉污染的控制等会极大地影响诊断结果。在实验室PCR结果的基础上，需要与临床症状、剖检病变结合，进行综合诊断。目前我们将该方法主要用于猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪瘟、猪流行性腹泻等病毒性疾病的诊断与净化控制过程。

3）血清学诊断：如：中和试验、ELISA、胶体金试剂条、免疫磁珠法等。目前主要利用ELISA评价免疫后抗体的水平。临床成熟应用的血清学疾病诊断方法主要是伪狂犬（PRV）ELISA gE抗体试剂盒。试剂盒已经标准化。但因为当前国内种猪群PRV的感染率较高，母源抗体携带的gE抗体（可持续12～14周龄以上）有时会干扰结果的解读。对于PRV阴性场，PRV的gE抗体的产生也需要7～10 d以上，发病初期的gE抗体滴度低，很容易做出假阴性的判断。对于发病初期，最好利用PCR进行诊断结果验证。对于已完成猪蓝耳病净化且不免疫蓝耳疫苗的猪场，也可利用PRRSV血清抗体检测作为猪蓝耳病毒感染的有效诊断方法。未来也可尝试利用唾液样品，进行阴性场PRRSV感染的监控。

4）显微病理诊断：因病理切片制备的设备投入大，病理切片解读需要较丰富的临床经验，故目前我们实验室尚未开展此方法。但病理诊断依然是最可靠、最传统的诊断方法，值得学习、推广。

2 市场上出售的很多方便、快捷的猪病检测试剂盒是否使用过？您认为有哪些优缺点？

曲向阳：目前曾使用的标准化诊断试剂盒包括：ELISA试剂盒、PCR试剂盒、胶体金快速诊断试剂条等。

1）ELISA试剂盒商品化的较多，但需要对所选试剂盒的品质（特异性与敏感性）进行评价，ELISA结果的解读对于很多规模化猪场的技术人员来说依然是难点。如：猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病、口蹄疫、猪圆环病毒病、猪支原体肺炎等。

2）FIRST-test 回肠炎诊断试剂盒，采用免疫磁珠法，对劳森氏菌直接检测。特异性好，敏感性强，可在回肠炎的感染评价上应用。但因猪场中回肠炎感染比例高，不推荐将此方法作为急性回肠炎诊断的方法（可依靠剖检诊断，病变较典型）。

3）PCR试剂盒偶有使用。我们主要以自己建立的PCR检测体系为主。因病原的变异，有时会导致PCR检测假阴性，需要定时更新PCR检测体系。

4）胶体金试剂条：目前效果较好的是PEDV试剂条、瘦肉精检测试剂条等。敏感性与特异性相对较好。

王艳丰：目前，市场上销售的猪病检测试剂盒较多，既有国产的（如武汉科前、北京世纪元亨等），也有进口的（如美国IDEXX、韩国金诺、荷兰BioChek、瑞士Prionics等），每个实验室可以根据检测对象、检测要求和检测目的，选择适合自己实验室的猪病检测试剂盒。优点是简单便于操作，敏感性和特异性高，批间变异系数小，检测所需时间短，2～3 h内即可以出现结果。但在实际应用中也存在一些问题，如不同公司生产的猪病检测试剂盒对同一份血清抗体检测结果存在差异，有时差异较大，灵敏度也存在差异，符合率低；试剂盒检测结果与参考血清的中和试验结果符合率低；由于不同的试剂盒有不同的检测方法，如单抗阻断、双单抗阻断和多抗阻断等，有些试剂盒其板孔包被抗原的来源也不同，故每种试剂盒的特异性与敏感性完全相符的可能性较小，用不同试剂盒检测抗体，其抗体的阻断率会出现差异。

3 猪病检测过程中如何正确地进行病料的采集与保存？

焦连国：病料的正确采集与保存是至关重要的，是实验室检测的第一步。病料的采集要按照下面进行：1）准确掌握发病信息：详细掌握猪场的疫病状况，评估可能的疫病种类；2）要选择发病典型有代表性的猪；3）样本数量科学：这是目前检测中的不足之处，往往被忽视。建议按发病前中后各取2头猪，共取6头，流产胎儿采集6窝，每窝采集典型胎儿2头，流产母猪的血液采集10～15份；4）做好剖检记录：现场记录与拍照相结合，由于检测的疫病种类有限，特别是细菌性疾病，剖检是评估细菌病危害的重要途径；5）科学采集病料，不同病原体对猪的侵害器官是不同的，同一种病原体在不同组织器官的含量与存在时间是不同的。例如：猪伪狂犬病原检测最敏感的是脑组织。采样一般要采集到猪的脑、扁桃体、肺脏、腹股沟淋巴结、脾脏、肾脏、肠道（猪腹泻）、血液等。6）病料采集一定要快，减少暴露在外界的时间，特别是要做细菌分离的，避免腐烂变质。采集病料要注意避免病料的交叉污染，尽量减少消毒液浸泡与洗涤组织。病料保存要注意：1）血液冷藏保存，运送时放到泡沫箱内并加冰袋；2）组织与胎儿冷冻保存，温度越低，病原体保存越久；3）细菌分离的样品，短期冷冻后尽快送检。

陶明华： 1）选择临床症状比较典型，能代表整个猪群发病特点的病猪2～3头以上进行剖解。在客户同意的情况下，如有必要，可以剖检1～2头发病猪群前5～7 d的健康猪，了解猪病的发病规律。 2)送检的病料主要以腹股沟及肠系膜淋巴结、扁桃体、肺脏、肾脏、脾脏为主，注意做细菌分离的内脏必须完整，解剖时避免污染。 3)细菌性疾病的诊断及检测，需要对送检的病猪停药5～7 d（包括针剂注射和饲料、饮水给药），方可解剖病猪，取所需病料送检。4)血清学抗体检测时，根据猪场的不同阶段，按照每个阶段的群体随机抽样5%～10%份血样。每份血样采集2～5 mL，静置平放15～20 min，充分析出血清后2～8 ℃冷藏保存。5)样品登记及猪场背景信息描述清楚（场名、样品数量、送检人及联系方式、猪场免疫程序、猪群疫病发生情况及用药治疗等，一式两份（一份留档，一份同病料送至检测实验室）。6)注意事项:①采取病料的种类，根据不同的疫病或检验目的，采取相应的血样，活体组织，脏器、肠内容物、分泌物、排泄物或其他病料。②内脏病料的采取，建议剖检活体：如患猪已死亡3 h以上，不予采取病料。③活猪组织取出后，不能直接放入冷冻环境，先置于室温待温度降下来后再放入冰箱或冰盒中储存。④做好人身防护，必须带手套，必要时带口罩，严防人畜共患病。

4 面对大专院校、科研院所、猪病检测实验室等诸多的猪病检测单位，应如何去选择检测单位？如何确保检测的准确性，要注意什么？

左玉柱：近年来，由于猪病日益复杂化，混合感染较多，单纯依靠临床诊断很难确诊，因此各大专院校、科研院所和猪病检测实验室等都逐渐推出了实验室检测服务。猪场在选择检测单位时，首先应该考虑检测单位的中立性，只有中立的，不代理销售产品的实验室才能保证结果的可靠性。其次，应该考虑检测单位的技术水平，检测过程不但涉及到仪器设备，试剂盒，而且涉及到检测人员的操作，这些都是直接影响检测效果的因素。因此，要确保检测的准确性，在选择检测单位时，还需要注意以下问题：

1）检测单位有相应的硬件设施。检测过程中，无论是采用ELISA方法对抗体进行检测，还是采用PCR方法对病原进行检测，都需要相应的仪器设备，因此如果一个检测单位不具备相应的硬件设施，那么该单位采用的检测方法应该是一些便捷的，不需要特殊仪器设备的方法，这些方法的简单快捷，但往往准确度差。

2）检测单位采用的试剂盒是应该是质量比较过关的试剂盒，许多检测单位为了在收费价位上迎合猪场的需要，采取了一些低价质劣的试剂盒，尽管检测费用比较低，但是准确度很差，不但起不到指导生产的作用，而且可能会误导猪场。

3）检测单位要具备相应的技术实力。许多检测机构认为只要购置了相应的试剂盒，就可以按照操作说明进行，但在实验过程中涉及需要操作细节，这些细节影响了结果的准确性和可靠性。另外，检测数据的分析，也需要与生产实践紧密结合，否则也很难指导生产，这些需要既熟悉检测操作，又熟悉疫病的基础理论和临床特点的技术人员来完成。

陶明华：选择中立的实验室检测，不要去带有商业性的检测机构。

5 您所了解的最新猪病检测技术有哪些？请简单介绍下这些新检测技术。

左玉柱：猪病检测技术现在较多，血清学检测方面包括ELISA方法，免疫胶体金方法，正向（反向）间接血凝法等；病原检测包括PCR（RT-PCR）法，荧光定量PCR法，荧光显微镜法，ELISA法；细菌学方面的分离培养和染色法。在众多的方法中，检测抗体使用较多的是ELISA方法，检测病原（病毒）应用较多的是PCR（RT-PCR）方法和荧光定量PCR方法；检测细菌采用细菌的分离培养。

ELISA方法逐渐成为国际和国内检测抗体的常用方法，ELISA方法具备较多的优点，比如检测可以批量化操作，利用其对规模化猪场进行检测；检测结果数字化，减少了人为判定结果的误差；抗原的特异性高，使得检测也具备高度的特异性，减少了其他抗体的干扰。PCR检测方法，是基于病原基因水平的检测技术，该方法具备特异，灵敏等优点，不需要对病原进行分离鉴定，直接进行基因的特异扩增，从而根据特异性的条带进行病原的定性。而荧光定量PCR方法，是在传统PCR的方法上进一步采用发光技术使产物得以量化，从而不但可以进行定性检测，而且可以对模板进行相对定量，了解感染的程度。由于该检测需要使用荧光定量PCR仪，因此在一些基层检测单位一般难以开展。

6 您认为未来猪病检测技术应朝哪个方向发展？

左玉柱：对于检测技术的开发，许多研究机构一直致力于简便快捷的检测技术，以其便于在基层推广应用。但这些便捷的检测方法，尽管具备操作简单，不需要特殊的仪器设备等优点，但检测结果往往特异性差，因此目前一般只是养殖户或小型养殖场使用。而随着我们养猪业的发展和升级，散户会逐渐退出市场，规模化饲养程度会越来越高，这种情况下，对检测结果的要求也会越来越严，因此今后猪病检测技术，应该朝着数据化，特异性，敏感性发展。检测机构也将越来越走向专业化，不但拥有相应的仪器设备，采用优质的试剂盒，而且具备一流的检测技术人员和数据分析专家，这些对检测技术的推广应用都极为关键和重要。

焦连国：我国正从养猪大国向追求产品质量的养猪强国迈进,未来一段时间我国养猪业面临的最大挑战仍是疫病。猪群健康是疫病防控之本，疫病的控制不能只停留在被动免疫和治疗上，而是猪场需要建立一套因地制宜、切实可行的疫病预警与免疫监测评价系统，从而避免仅仅注重治病与表面重视疫苗免疫而忽视了猪群本身的健康。未来猪病检测技术是利用各种敏感性高与特异性强的检测手段验证猪体内病原体是否存在的过程。它包括病理学、血清学、病原学、分子生物学诊断等一种或多种检测方法。猪场通过相关检测技术一方面可以确定病原和猪体之间的关系，明确疫病存在状况，在一定的时间段对病原体的发生、发展、流行、分布及相关因素进行系统的调查与疫情监测；另一方面通过免疫抗体的检测结果以衡量免疫水平，进行免疫评估。未来检测技术发展方向具有以下几点：1）注重抗原检测，与检测抗原相关的技术得到发展与应用；2）检测技术更科学，利用最先进仪器与技术，在提高特异性的同时会更加注重提高敏感性；3）样本检测更加广泛：血液、唾液、鼻拭子、乳汁、胎儿、精液、组织等样本的检测技术得到研究与应用；4）行业检测标准会统一：这有利于各实验室技术交流与检测水平评价。