益气活血中药对急性心肌梗死病人血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达的影响

朱敬伟，戴国华，姚　静，刘　宁，宋宪波，马培泽

1.山东中医药大学(济南 250014)；2.山东中医药大学附属医院；3.山东省济宁市中医院；4.山东省威海市中医院



益气活血中药对急性心肌梗死病人血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达的影响

朱敬伟1，戴国华2，姚静1，刘宁3，宋宪波3，马培泽4

1.山东中医药大学(济南 250014)；2.山东中医药大学附属医院；3.山东省济宁市中医院；4.山东省威海市中医院

摘要：目的观察益气活血中药对急性心肌梗死(AMI)病人血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达的影响。方法将AMI病人30例随机分为治疗组和对照组各15例，治疗组予常规西药联合益气活血中药治疗，对照组予常规西药治疗，疗程2周。健康志愿者10名为健康组。健康志愿者于入组时，AMI病人于入院后1 h、第3天、第7天、第14天分别抽取肘静脉血，实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miR-223-3p、 miR-132-5p的表达情况。结果AMI病人入院早期miR-223-3p出现高表达、miR-132-5p出现低表达，与健康志愿者比较差异有统计学意义(P<0.01)；与miR-132-5p及肌钙蛋白I(cTnI)比较，miR-223-3p显示出高表达、高敏感性的特点。与对照组比较，治疗组治疗后病人血浆 miR-223-3p表达降低、miR-132-5p表达上调更显著，差异有统计学意义(P<0.01)；cTnI于24 h上升和第3天下降更为明显(P<0.05)。结论益气活血中药联合常规西药治疗AMI较单纯常规西药治疗临床疗效较好，可能与调节miR-223-3p、miR-132-5p的表达有关，miR-223-3p有望成为新的AMI早期诊断标志物。

关键词：急性心肌梗死；益气活血中药； miR-223-3p；miR-132-5p；肌钙蛋白I；胸痹

急性心肌梗死(AMI)是临床常见的急危重症，早期诊断及治疗尤为重要。临床研究发现，约25% AMI病人发病早期并没有典型的临床症状[1]，目前首选的心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白在AMI发病初期多无明显异常，亦或超过临界值仍缺乏诊断特异性，有必要寻找更准确、更敏感的生化标志物。前期动物实验研究发现，促进缺血心肌血管新生的核心microRNA为表达上调的miR-223-3p、表达下调的miR-132-5p。临床研究发现，miR-223-3p在AMI发病早期即可出现高表达，且比肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白I(cTnI)的时间窗更早[2-5]。本研究在此基础上，进一步观察益气活血中药治疗后AMI病人血浆miR-223-3p、miR-132-5p的表达变化，分析其对AMI早期诊断的临床价值，为心肌梗死中医药治疗提供新的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料收集山东中医药大学附属医院2013年7月—2014年12月收治的30例AMI住院病人，参照2012年ESC/ACC/AHA/WHF工作联盟发布修订后的第3版心肌梗死全球统一定义，随机分为治疗组、对照组各 15例。治疗组和对照组各脱落1例，治疗组14例，年龄(58.21±7.55)岁，对照组14例，年龄(55.87±8.29)岁。同时选10名健康志愿者为健康组，年龄(56.72±5.37)岁。各组病人性别、年龄、AMI类型、冠心病危险因素等资料经统计学处理，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2治疗方法对照组予常规西药治疗，包括：阿司匹林、硝酸酯、低分子肝素、β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和(或)血管紧张素受体拮抗剂。治疗组予常规西药联合益气活血中药治疗，益气活血中药包括：参麦注射液、参芪扶正注射液、丹红注射液、芪参益气滴丸。疗程2周。

1.3主要试剂及仪器Trizol(Invitrogen life technologies)，MMLV反转录酶(Epicentre)，反转录试剂盒(北京天根生化科技公司)，SYBR Premix Ex TaqTM real-time PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)，高速低温离心机(美国Thermo Scientific公司)，实时定量PCR扩增仪、反转录仪(美国Applied Biosystems公司)，引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.4观察指标

1.4.1中医证候积分参照国家药品监督管理局2002年颁布的《中药新药临床研究指导原则》中的“中药新药治疗冠心病心绞痛的临床研究指导原则”。

1.4.2cTnI水平检测抽取病人入院后1 h、24 h、第3天、第7天、第14天肘静脉血，免疫印迹法检测血浆cTnI水平。

1.4.3检测血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达情况抽取病人入院后1 h、第3天、第7天、第14天以及健康志愿者肘静脉血，real-time PCR检测血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达情况。TRIzol提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的纯度及浓度。根据逆转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA；选miR-93作为内参，逆转录引物序列如下，miR-93 GSP：5′GGCAAAGTGCTGTTCGTG3′，R：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′； miR-223-3p GSP：5′GGGGTGTCAGTTTGTCAAA3′，R：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′； miR-132-5p GSP：5′GGACCGTGGCTTTCGATT3′，R：5′GTGCGTGTCGTGGAGTCG(GSP是对应microRNA的特异引物，R是与RT引物相匹配的引物)。real-time PCR按照说明书进行操作。获得产物扩增曲线、融解曲线及CT值(每个反应管中的荧光信号到达设定的阈值经历的循环数)。计算各样本的△Ct值(目的基因Ct值-内参基因Ct值)，组间表达差异用2-△△Ct(△△Ct=△Ct治疗组-△Ct对照组)表示。

2结果

2.1中医证候积分比较对照组和治疗组治疗前的中医证候积分比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗组治疗后中医证候积分低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，治疗组证候改善情况明显优于对照组。详见表1。

表1　治疗组与对照组中医证候积分比较(±s) 　 分

2.2cTnI比较入院1 h已开始升高，24 h达到高峰，第2天开始下降并于第7天接近正常水平。而治疗组于入院24 h和第3天cTnI升高程度明显低于对照组(P<0.05)。详见表2。

表2　治疗组与对照组cTnI的动态监测结果(±s) 　ng/mL

2.3血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达情况2.3.1健康组、AMI组血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达比较AMI病人入院1 h miR-223-3p的表达水平较健康者明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，miR-132-5p表达水平较健康者明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表3。miR-223-3p、miR-132-5p与miR-93扩增及溶解曲线见图1。

表3　健康组、AMI组miR-223-3p、miR-132-5p的Ct值(±s)

注：A代表miR-223-3p扩增曲线；B代表miR-223-3p熔解曲线；C代表miR-132-5p扩增曲线；D代表miR-132-5p熔解曲线；E代表miR-93扩增曲线；F代表miR-93熔解曲线。

图1real-time PCR检测miR-223-3p、miR-132-5p扩增曲线及熔解曲线

2.3.2治疗组与对照组血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达比较治疗后，两组AMI病人miR-223-3p表达均出现不同程度下降，治疗组下降更为显著(P<0.05)；而miR-132-5p表达均出现不同程度的上升，治疗组上升更为显著(P<0.05)。详见表4。

表4　治疗组与对照组治疗前后miR-223-3p、miR-132-5p表达( 2-ΔΔCT)(±s)

2.3.3益气活血中药对AMI病人血浆miR-223-3p、miR-132-5p表达的影响AMI病人入院1 h的血浆miR-223-3p水平即达峰值，以后逐渐降低，治疗第7天后下降减缓。治疗组miR-223-3p水平下降较对照组更明显。miR-132-5p的表达水平持续降低至入院后第3天，之后逐渐上升并持续到第14天。从治疗后第3天开始，治疗组miR-132-5p表达水平上升更明显。详见表5、图2。

表5　miR-223-3p、miR-132-5p的表达量比较(2-ΔΔCT)(±s)

图2入院后病人血浆miR-223-3p、miR-132-5p的表达情况

3讨论

microRNA是一类在进化上具有高度保守性的非编码小分子RNA，具有组织特异性和时序性，只在特定的组织和特定的发育阶段表达，生物信息学分析，人类约30%的基因受microRNA调控，表明microRNA可能影响所有的信号途径[6]。随着microRNA研究的不断开展，microRNA相关的检测技术已趋成熟。通过microRNA表达谱芯片和real-time PCR技术可以精确地定量分析microRNA的表达[7]，经常用于验证预测的microRNA。中药有效成分具有多环节、多层次、多靶点的作用特点，而且中药复方在相互配伍后的作用较为复杂，可通过调节microRNA的表达发挥多基因治疗的效果。

现代医学研究使人们对血管新生机制的认识日渐深入，益气活血中药在促血管新生方面的作用亦已得到证实。芪参益气滴丸是益气活血中药治疗冠心病心肌缺血的代表性品种之一。相关研究证实该药可显著促进缺血心肌血管的新生，但目前基于microRNA探讨中药促血管生成的研究报道尚少[8-9]。以往关于缺血心肌血管新生的过程及其调控网络的研究，多集中于促血管生长因子及其信号转导机制方面。2006年研究人员首次报道了microRNA的表达特征与小鼠和人类的心脏衰竭以及心肌肥厚相关[10]，进而引发了医学界对microRNA在心血管中作用的深入研究。

本研究在前期动物实验和临床研究的基础上，进一步观察益气活血中药对AMI病人血浆中miR-223-3p、miR-132-5p的表达影响。研究发现，在发病初期，治疗组和对照组血浆miR-223-3p水平较健康组升高，而miR-132-5p水平较健康组降低，治疗后两组miR-223-3p出现不同程度的下降，而miR-132-5p出现上升，与对照组比较，治疗组改善更为明显(P<0.05)。说明益气活血中药联合常规西药对AMI病人血浆miR-223-3p及miR-132-5p的调节作用均优于常规西药治疗。同时，治疗后，治疗组病人主要临床症状减轻较对照组更为显著，因此推测在心肌梗死发病过程中，病情的发展可能与调节miR-223-3p、miR-132-5p的表达有关。在外周循环血浆中microRNA具有一定的稳定性和易检测性[11]，且随着生物科技的发展，对于microRNA的检测及分析将会更加精确和迅速，因此，在未来心肌损伤的诊治过程中，miR-223-3p和miR-132-5p很有可能成为重要生物学标记物。另外，受试者血浆中miR-223-3p的基础表达量明显高于miR-132-5p，同时结果提示，AMI病人入院早期血浆miR-223-3p及miR-132-5p即出现差异表达，而miR-223-3p较miR-132-5p、cTnI、CK-MB等常规AMI诊断标志物具有更早的表达时间窗以及更早的达峰时间，这一结果表明，在心肌梗死发病初期，与miR-132-5p、cTnI、CK-MB比较，miR-223-3p具有高表达、高度敏感性的特点，因此早期检测miR-223-3p的表达量对急性心肌梗死的诊断可能具有更高的临床价值。

肌钙蛋白是临床上目前最常用的心肌损伤标志物，通常在心肌梗死后4 h～8 h内才开始升高[12]，且根据心肌损伤程度具有较大差异。而经过动物实验证实，microRNA在进行冠状动脉结扎手术后1 h即可升高，其敏感性显著高于肌钙蛋白[13]。在诊断灵敏性上，microRNA比现有的cTnI及CK-MB等具有更高的特异性及灵敏性。本研究结果显示，两组cTnI于入院1 h已开始升高，第3天时达到高峰，第7天大致下降到正常水平；而与对照组比较，治疗组在入院24 h和入院第3天时cTnI升高程度较低，差异有统计学意义。说明运用益气活血中药治疗能减轻心肌损害，并使心肌损伤在更短的时间内恢复。而前期研究结果表明，miR-223-3p相较于cTnI和CK-MB具有更早的时间窗，且与cTnI呈正相关关系[5]，表明microRNA可以作为早期诊断AMI的标志物，为血管再通提供更加宝贵的时间。检测效率方面，microRNA主要通过PCR仪分析，比肌钙蛋白的检测更加快捷方便。因此，microRNA相比于肌钙蛋白更具有临床实用价值，对心肌梗死的诊断具有更强的灵敏性。

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(本文编辑郭怀印)

(收稿日期：2015-12-18)

中图分类号：R542.2R289.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.004

文章编号：1672-1349(2016)09-0939-05

通讯作者：戴国华，E-mail: daigh2004@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81173441)；山东省中医药科技发展计划项目(No.2015-297)