基于气相色谱质谱联用对冠心病“痰”“瘀”证候血清代谢组学的研究

鹿小燕，顾　焕，徐　浩，赵　铁，李　耿



基于气相色谱质谱联用对冠心病“痰”“瘀”证候血清代谢组学的研究

鹿小燕1，顾焕1，徐浩2，赵铁1，李耿1

摘要：目的 研究冠心病痰证、瘀证病人血清代谢组学特征。方法选择冠心病稳定期病人102例，其中痰证52例、瘀证50例，31名健康者，利用核磁共振谱(GCMS)和色谱/质谱(LC/MS)联用、模式识别技术等现代分析技术，比较痰证、瘀证冠心病病人和健康人的代谢物组谱差异，对同病异证病人间代谢物组谱差异进行分析。结果在多种氨基酸、有机酸、长链脂肪酸类、溶血磷脂类、磷脂类、鞘磷脂等代谢物方面，冠心病组相对于健康对照组表现出明显的差异，其中大部分的差异代谢物也是痰浊组和血瘀组的共性代谢物。冠心病组有机酸、麦芽糖、多种氨基酸较健康对照组明显升高，而多种不饱和脂肪酸及衍生物、维生素E、胆固醇等显著降低。痰浊组和血瘀组的特性差异代谢物主要有苹果酸和琥珀酸，果糖和葡萄糖，甘氨酸和丙氨酸以及棕榈烯酸等。其中7，10-顺十六碳二烯酸和DPA在痰浊组中降低，其余则在血瘀组中浓度升高。 结论冠心病有特异性的代谢组特征，痰浊和血瘀既有特性差异性代谢物，也有共性代谢物，二者异中有同，同中有异。痰浊和血瘀有共同的物质基础，这与中医理论的“痰瘀同源”是一致的，作为致病因子，二者在体内可以相互转化，共同致病，亦即“痰瘀同病”，因而在治疗时可以考虑痰瘀同治，提高疗效。

关键词：冠心病；代谢组学；痰证；瘀证；病证结合；胸痹

痰证、瘀证为冠心病的两大主要证候，二者常互兼夹、互为转化，为临床辨治带来了困难。目前，冠心病血瘀证的研究较为深入，认为与血液循环障碍、血小板聚集、血栓形成、微循环异常等密切相关，但痰证实质研究还比较薄弱，且多局限于某个指标或几个指标。二者的物质基础有何异同？如何相互影响？能否有更敏感的微观指标？均亟待阐明。代谢组学技术融动态、综合、分析于一体，从整体角度研究人体代谢网络在疾病状态下的变化规律，为证候实质研究带来了契机[1-2]。本研究即采用病证结合研究方法，以冠心病“痰”“瘀”证病人为研究对象，利用代谢组学技术，通过同病异证病人间代谢物组谱差异分析，探讨其证候产生的物质基础及异同点。

1资料与方法

1.1诊断标准

1.1.1西医诊断标准参照1979年国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专业组的制订的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》。

1.1.2中医诊断标准参照1990年中西医结合心血管学会修订的《冠心病中医辨证标准》。血瘀证计分标准参照中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的血瘀证诊断标准。

1.2纳入标准年龄35岁～80岁；经冠脉造影确诊为冠心病，符合西医诊断标准及中医辨证标准的稳定期病人；经医院伦理委员会批准，签署知情同意书。

1.3排除标准急性心肌梗死；血液系统疾病；合并糖尿病和甲状腺功能亢进等内分泌疾病者；肝肾功能不全或肺心病；恶性肿瘤病人；参加其他临床试验者。

1.4一般资料选择门诊、住院的冠心病稳定期病人102例，其中痰浊证52例(T组)，平均年龄62.12岁，男43例，女9例；血瘀证50例(Y组)，平均年龄62.22岁，男37例，女13例；健康者31名(C组)，平均年龄63.62岁，男22例，女9例。排除既往冠心病病史、肝肾功能、电解质明显异常者。3组之间年龄、性别差异无统计学意义。

1.5观察指标及方法冠心病痰浊证、血瘀证病人及健康对照者入组时均空腹抽取肘静脉血约10 mL，分离血清，-80 ℃冰箱冰冻保存待测。气相色谱质谱联用方法进行代谢物测定。

1.5.1样品制备及衍生化从超低温冰箱中取血清，室温解冻，精密移取100 μL血清置于1.5 mL离心管中，加入20 μL十七酸和氯苯丙氨酸混合内标溶液后加入300 μL甲醇，涡旋混合30 s，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液作为供试品溶液。将300 μL上清液转移到带有内插管的样品瓶中，在真空离心浓缩干燥仪上浓缩至干，然后进行三甲基硅烷(TMS)衍生化。将50 μL甲氧胺(15 mg/mL溶解在吡啶中) 溶液加入干燥的样品中，涡旋振荡30 s，然后置于摇床中恒温30 ℃，肟化羰基，90 min后取出，加入50 μL BSTFA (containing 1% TMCS)，涡旋振荡30 s，静置于70 ℃鼓风干燥箱中硅烷化反应1 h。

1.5.2气质联用分析衍生化后的样品以不分流模式注入到GCtofMS中进行分析，进样量为1 μL，色谱柱为DB-5 毛细管柱(30 m ×250 μm，0.25 μm film thickness)，载气为氦气，流速为1.0 mL/min。进样温度设定为270 ℃。柱温梯度为80 ℃ 维持2 min，然后以10 ℃/min程序升温至180 ℃，5 ℃/min升至240 ℃，25 ℃ /min升至290 ℃，维持9 min，然后回到起始温度。传递线(transfer line)温度和离子源温度分别为260 ℃和200 ℃。质谱采用电子轰击源(70 ev)及全扫描模式，扫描范围为30 m/z～600 m/z。GCtofMS

代谢组分析平台样品前处理-衍生化反应流程详见图1。

图1GCtofMS代谢组分析平台样品前处理-衍生化反应流程图

1.5.3数据处理将GCtofMS分析所得的质谱数据由ChromaTOF工作站软件以NetCDF格式导出。这些CDF文件用Matlab 7.0工具箱中hierarchical multivariate curve resolution (H-MCR)修改的用户自定义程序进行数据前处理提取特征变量，包括基线矫正、去噪、平滑、对齐，时间-窗口分裂，多元曲线分离(基于多元曲线分离算法)等。所得三维数据集包括样品信息、峰保留时间和峰强度。数据集中内标和由噪音、柱流失及BSTFA衍生化引起的人造峰须先被除去。

所得数据集导入SIMCA-p 11.5 软件进行多元统计分析。数据首先经过中心化和Parto处理，然后进行主成分分析(PCA)或偏最小二乘判别分析(PLSDA)。PCA是一种非监督的模式识别方法，可以用来判断多维数据集的一般聚类情况。PLSDA是一种有监督的模式识别方法，一般用来建立组间的预测模型，判别多维变量在组间是否存在明显的差异。在本研究中应用软件中默认的7轮交互验证方法以防止模式的过度拟合。应用独立样本t检验比较组间均值是否存在显著差异，健康者与冠心病病人显著性差异的标准设为P<0.01，而冠心病组对证和不对证治疗前后的显著性差异标准为P<0.05。计算每个差异变量相应的倍数变化，以显示它们在模型组以及治疗前后的变化程度。

1.5.4代谢物鉴定通过用NIST MS search 2.0软件比较质谱碎片与NIST 08标准质谱库(相似度超过70%)，并最终用标准品验证的。

2结果

2.1基于气质联用仪的代谢组学分析及特征变量提取经GCMS分析后，各组血清样本的代谢指纹色谱图被记录下来。在一个分析流程中多种不同的体内内源性代谢物可同时被检测到。从直观的色谱图中可以发现，有一些谱峰在模型组与对照组之间存在着明显的差异。但是，这些视觉观测的结果需要进一步的统计分析验证。经过峰识别和峰匹配，正、负离子模式分别约有200多个特征变量用于进一步的多维和单维模式识别分析，其中有约100个代谢物被鉴别出来。详见图2。

注：A 为血瘀证组；B 为痰浊证组；C 为健康组。

2.2模式识别分析及证候的共性和特性代谢物鉴定

2.2.1冠心病组与健康对照组的PCA和PLSDA从冠心病组和健康对照组样本的PCA结果可以看出，健康对照组与冠心病组不能分开(见图3)。于是进一步采用有监督的模式识别方法PLSDA，可以看出两组可以基本分开，表明冠心病病人和正常人之间的代谢物谱存在一定的差异(见图4)。

图3　治疗前各组样本GCMS数据的主成分分析

图4 治疗前各组样本GCMS数据的偏最小二乘判别分析

2.2.2冠心病组与健康对照组的差异代谢物的识别和鉴定通过单维t检验的方法，识别出健康对照组和冠心病痰浊组病人、健康对照和冠心病血瘀组病人以及冠心病痰浊组和血瘀组之间的差异变量。

冠心病组血清中的有机酸(如乳酸、乙醇酸、琥珀酸、苹果酸)、麦芽糖及多种必需氨基酸(包括丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、戊二酸、天冬氨酸、4-羟脯氨酸、2-羟戊二酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)相对于健康对照组明显升高；而2-哌啶酸(赖氨酸衍生物)、甘油醇(甘油、2-磷甘油、3-磷甘油属于有机化合物)，1，5-酐-D-山梨糖醇(糖的衍生物)，维生素E(高效抗氧化剂，可使细胞膜免受自由基的伤害，保护机体)，胆固醇，多种长链不饱和脂肪酸及衍生物[包括肉豆蔻酸、棕榈酸甲酯、棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸甲酯、反式油酸甲酯、顺式-11-十八烯酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸、油酸、硬脂酸、甲基(8E，11E，14E)-8，11，14-二十二碳三烯酸酯、顺式-11，14-二十碳二烯酸、顺式-11-二十烯酸、二十烷酸、4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、肌苷、单硬脂酸甘油酯]则显著降低。

2.2.3痰浊组和血瘀组的共性和特性代谢物的识别和鉴定同时满足独立t检验的P1(T vs C)和P2(Y vs C)小于0.05的特征变量作为痰浊和血瘀组的共性代谢标记物。许多冠心病和健康对照者之间的差异代谢物也是痰浊和血瘀的共性代谢物，比如胆固醇，维生素 E，小分子有机酸乳酸和琥珀酸，多元醇肌苷、甘油、麦芽糖等，多种氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等及多种长链脂肪酸类如二十烷酸、顺式-11-二十碳烯酸、亚油酸、油酸、棕榈酸等及其甲基化物。而痰浊组和血瘀组的特性差异代谢物主要包括有机酸(苹果酸和琥珀酸)，糖类果糖和葡萄糖，必需氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)以及脂肪酸(棕榈烯酸)等。

而痰浊组和瘀血组的特性代谢物主要有5-羟色胺(色氨酸的衍生物)/可替宁(生物碱、尼古丁在人体内进行初级代谢后的主要产物)、溶血卵磷脂、7，10-十六碳二烯酸、长链不饱和脂肪酸DPA和PI(38∶3)，苹果酸和琥珀酸，果糖和葡萄糖，甘氨酸和丙氨酸以及棕榈烯酸等。其中7，10-十六碳二烯酸和DPA在痰浊组中降低，其余则在血瘀组中浓度升高。

3讨论

近年来，随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变、竞争的日益激烈以及空气环境的污染，使冠心病的中医证候谱发生了较大变化，肥胖、饮食不节、嗜烟酒等使冠心病痰浊证所占比例有所增加，痰证、瘀证成为冠心病最重要的两大证型[3]。

本研究显示，与健康组比较，冠心病组在葡萄糖、蛋白质、脂肪代谢方面均有异常，具体表现在葡萄糖代谢产物、氨基酸明显增加，脂肪代谢产物显著降低。葡萄糖是缺氧时较好的能量基质，可改善心肌的电和机械性能，维持细胞的超微结构，促进心肌修复力，保持细胞内三磷酸腺苷浓度，减少心肌磷酸激酶的丢失和延迟线粒体损伤，冠心病病人存在心肌缺血缺氧，因此葡萄糖的消耗较健康者明显增加；其次冠心病病人体内多种氨基酸增加，尤其必需氨基酸增加更明显，这与国内同行的研究结果是一致的[4-6]。冠心病病人自由基脂质过氧化反应活跃，影响内分泌而使分解激素增加，能量消耗加速，导致全身能量缺乏，因而使机体内个别氨基酸含量上升。此外本研究显示冠心病病人体内脂肪代谢产物显著降低，说明体内脂肪动员程度下降，血浆脂质含量增加，脂肪在体内堆积，可使血管内皮受损，而过多的氨基酸又为脂质合成提供了充足原料，进一步加重了脂质代谢的异常，导致脂质代谢紊乱，最终促进了动脉粥样硬化的发生和发展。冠心病病人与细胞膜保护和免疫功能有关的代谢物如磷脂、肌苷等代谢物的含量亦比健康对照组降低，表明冠心病病人体内细胞膜有一定程度的破坏，免疫功能下降。

大部分冠心病和健康对照组之间的差异也是痰浊组和瘀血组的共性代谢物，比如磷脂、胆固醇，维生素E，小分子有机酸、尿酸，多元醇肌苷、甘油、麦芽糖等，多种非必须氨基酸、多种长链不饱和脂肪酸及其甲基化物。肌苷是机体内三磷酸腺苷(ATP)、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸的组成部分，参与机体的物质代谢和能量代谢。磷脂是维持生命活动的基础物质，是细胞膜的重要组成部分，可以分解过高的血脂和胆固醇，使中性脂肪和血管中沉积的胆固醇乳化为对人体无害的微粒，溶于水中而排出体外，同时阻止多余脂肪在血管壁沉积，清扫血管，使血管循环顺畅，被公认为“血管清道夫”。痰浊与血瘀证冠心病病人体内均存在磷脂和氨基酸的代谢异常，其中磷脂影响到其他各类代谢，磷脂在体内可经各种磷脂酶作用水解为甘油、脂肪酸、磷酸和各种氨基醇(如胆碱、乙醇胺、丝氨酸等)；甘油可以转变为磷酸二羟丙酮，参加糖代谢；脂肪酸经β-氧化作用而分解；磷酸是体内各种物质代谢不可缺少的物质，各种氨基醇可以参加体内磷脂的再合成，胆碱还可以通过转甲基作用转变为其他物质。表明痰浊和血瘀具有共同的物质基础，这些物质在体内可以相互转化和相互影响，验证了痰、瘀作为津血代谢异常所化生的病理产物，同属阴，是津血为病的两个不同方面的表现形式，津血同源，痰瘀同源，痰瘀相关，痰瘀互化。本研究结果显示痰浊和血瘀虽然有共同的物质基础，但同中有异，二者的特性差异代谢物有苹果酸和琥珀酸、果糖和葡萄糖、非必须氨基酸甘氨酸和丙氨酸、不饱和脂肪酸棕榈烯酸等。

不饱和脂肪酸是构成体内脂肪的一种必需脂肪酸，可保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能；降低血中胆固醇和三酰甘油；降低血液黏稠度，改善血液微循环，提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力。研究结果显示Omega-3系列不饱和脂肪酸7，10-顺十六碳二烯酸和DPA在痰浊组中降低，其余在血瘀组中浓度升高，表明冠心病痰浊和血瘀组病人均存在脂代谢紊乱，痰浊组具有更高的血脂水平、血液黏稠度，血管细胞膜受损程度相对严重。血瘀证病人不饱和脂肪酸含量增高的结果与国内同行研究一致，可能与血瘀致心脉痹阻，心肌组织持续缺血、疼痛，造成生理应激，刺激肾上腺皮质、激活交感神经系统有关，使血中糖皮质激素和儿茶酚胺增高，致使机体分解代谢亢进，合成代谢降低，脂肪、糖原分解加快，血糖、脂肪酸水平会随之增高[7]。

对于冠心病痰浊和血瘀证候的血清代谢组学研究表明，冠心病有特异性的代谢组特征，痰浊和血瘀既有特性差异性代谢物，也有共性代谢物，二者异中有同，同中有异，这对于提高冠心病“痰”“瘀”证的辨识能力具有重要意义，也为冠心病证候实质的研究提供了客观依据。痰浊和血瘀作为致病因子，有共同的物质基础，这与中医理论的“痰瘀同源”“津血同源”是一致的，二者在体内可以相互转化，共同致病，亦即“痰瘀同病”，因而在治疗冠心病时可以考虑痰瘀同治，提高疗效。

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(本文编辑郭怀印)

Serum Metabonomics Analysis of Phlegm and Blood Stasis Syndrome in Patients with Coronary Heart Disease by Gas Chromatography-Mass Spectrometry Combined with Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Lu Xiaoyan，Gu Huan，Xu Hao，Zhao Tie，Li Geng

China Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the serum metabonomics characteristics of phlegm and blood stasis syndrome in patients with coronary heart disease(CHD).MethodsMetabolites spectral differences were compared between 102 patients with CHD (52 patients with phlegm syndrome and 51 with blood stasis syndrome) and 31 healthy individuals by analysis techniques of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)，liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) and pattern recognition technology.ResultsCHD group compared to healthy controls showed obvious difference in the metabolites including many kinds of amino acids，organic acids，long chain fatty acids，lysophospholipids，phospholipids，sphingomyelin；the most different metabolites also were common metabolites of phlegm and blood stasis group.The contents of organic acids，maltose，a variety of amino acids in CHD patients obviously increased than that in healthy control；while the contents of a variety of unsaturated fatty acids，derivatives，VitE，and cholesterol obviously decreased in CHD patients.Characteristic different metabolites in phlegm group and blood stasis group were mainly malic acid and succinic acid，fructose and glucose，glycine and alanine and palmitoleic acid.Among them，in phlegm group the contents of 7，10-Hexadecadienoic acid and DPA reduced，while the rest of them in blood stasis group increased.ConclusionCHD had specific metabolic group characteristics，phlegm and blood stasis had both characteristic different metabolites，also had common metabolites，which had important significance in improving identification ability of phlegm and blood stasis syndrome of coronary heart disease，also provided objective basis for CHD syndrome essence research.Phlegm and blood stasis had common material basis，which was coincident with Chinese medicine phlegm and blood stasis homologous theory.As pathogenic factors，both in the body could change into each other，and caused disease commonly，so treating phlegm and blood stasis simultaneously could improve curative effect.

Key words：coronary heart disease；metabnomics；phelgm syndrome；blood stasis syndrome；combination disease with syndrome

(收稿日期：2015-12-18)

Corresponding Author：Gu Huan

中图分类号：R541.4R256.2

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.001

文章编号：1672-1349(2016)09-0929-04

通讯作者：顾焕，E-mail：deerxiaoyan@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30901891)
作者单位：1.中日友好医院(北京 100029)；2.中国中医科学院西苑医院

·临床医学论著·