红枣乳酸发酵饮料的抗氧化活性

靳玉红，李志西，乔艳霞，杨　智，李　瑞，张　强

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)



红枣乳酸发酵饮料的抗氧化活性

靳玉红，李志西，乔艳霞，杨智，李瑞，张强

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 研究红枣乳酸发酵饮料的体外抗氧化活性，为红枣乳酸发酵饮料的进一步开发提供参考。【方法】 测定红枣乳酸发酵饮料不同发酵阶段体外DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+还原能力及总抗氧化能力，并与枣酒、原枣汁、枣酪饮料及酸枣汁饮料的抗氧化性进行比较。【结果】 在所选定的5种枣饮料中，红枣乳酸发酵饮料的抗氧化能力最高，其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+还原能力的Vc抗氧化当量(VCEAC)依次为(223.8±2.4) mg/L、(1 126.64±40.00) mg/L、(1 007.2±40.0) mg/L，总抗氧化能力T-AOC值为(56.98±0.41)；其次是枣酒，其4种抗氧化能力的VCEAC依次为(158.6±1.7) mg/L、(920.44±8.27) mg/L、(592.5±10.2) mg/L、(48.44±1.05)；酸枣汁饮料的抗氧化能力最低，其4种抗氧化能力的VCEAC依次为(81.9±0.7) mg/L、(30.67±1.07) mg/L、(156.2±10.5) mg/L、(23.45±0.30)。红枣乳酸发酵饮料的抗氧化活性与多酚类物质含量有显著相关性(P<0.05)。在乳酸发酵初期(0～12 h)，红枣乳酸发酵饮料的抗氧化能力显著增强(P<0.05)，发酵12～72 h时其DPPH自由基清除能力和Fe3+还原能力无显著变化(P>0.05)；发酵12～48 h其ABTS自由基清除能力无显著变化，发酵48～72 h 时其ABTS自由基清除能力显著增强。【结论】 红枣乳酸发酵饮料具有较强的抗氧化活性，且具有乳酸发酵特有的香味，口感柔和，是值得开发的一种枣饮料产品。

[关键词]红枣；乳酸发酵饮料；枣饮料；抗氧化活性

红枣(ZizyphusjujubeMill.)是鼠李科(Rhamnaceae) 枣属(ZizyphusMill.)植物的果实[1]。红枣是中国特有的经济果品，栽培面积约100 hm2，年产量约400万t[2]。枣果富含多种营养成分和抗氧化成分，其主要营养物质有多糖、有机酸、蛋白质、维生素B1和B2、VC、VA及钙、磷、铁等微量元素，鲜枣VC含量400～600 mg/kg[3]。枣果含有较丰富的黄酮、多酚等抗氧化物质，不同地区不同品种的红枣中多酚类物质的含量有所不同：韩志萍[4]研究表明，陕北不同产区枣果中黄酮类化合物的总量(以芦丁当量计)为2.972～7.646 mg/g；Li等[5]研究表明，我国5种红枣的总多酚含量(以每克干枣中含有相当没食子酸的毫克数表示)为5.18～8.53 mg/g。

目前关于枣酒、枣醋抗氧化活性的研究报道较多[6-8]，而对红枣乳酸发酵饮料体外抗氧化活性研究的报道尚较为少见。本研究以新疆大枣为原料，采用混合乳酸菌种子液生产红枣乳酸发酵饮料(Jujube beverage fermented with lactic acid bacteria,JBFLAB)，研究红枣乳酸发酵饮料在不同发酵阶段的体外抗氧化活性，以期为红枣乳酸发酵饮料的进一步研发提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

红枣，新疆和田枣；种子菌液，对实验室自制的酸菜汁进行净化处理和菌相稳定驯化后得到的混合菌液，其中优势菌为干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；枣酒，实验室自制，干枣加4倍水进行酒精发酵7 d得到酒精发酵醪，酒精度8°，补糖后二次发酵30 d得到枣酒，酒精度11°；原枣汁，干枣去核加4倍水，榨汁机压榨，离心分离得到未经发酵的原枣汁；枣酪饮料、酸枣汁饮料，新乡市及时雨饮品有限公司产品；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司产品。

其他主要试剂有：芦丁、没食子酸、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸)，均购于美国Sigma公司；亚硫酸钠、氢氧化钠、氯化钾、磷酸、磷酸二氢钾、无水乙醇、无水碳酸钠、抗坏血酸、K2S2O8等，均为国产分析纯。

1.2试验仪器

恒温培养箱(150A型)，江苏常州华普达教学仪器有限公司；紫外-可见分光光度计(UV-1700型)，日本岛津公司；双光束紫外分光光度计(UV-2550型)，日本岛津公司；台式离心机(TD5A型)，湖南凯达科学仪器有限公司；干燥箱(202-00型)，北京化玻联医疗器械有限公司；超声波清洗器(KH5200B型)，昆山禾创超声仪器有限公司；混匀器(QL-901 ZORTEX型)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3试验方法

1.3.1红枣乳酸发酵饮料的制备制备流程为:

1.3.2DPPH自由基清除能力测定[9]准确吸取稀释一定倍数的红枣乳酸发酵饮料、枣酒、酸枣汁饮料、枣酪饮料及原枣汁各100 μL，用去离子水补至2 mL，再加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，混匀，避光放置30 min后用无水乙醇作参比液，在波长510 nm处测定其吸光度Ai，然后测定2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度Ac，同时测定2 mL相应质量浓度的样品溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度Aj，按下式计算DPPH自由基清除率：

样品的DPPH自由基清除能力以Vc抗氧化当量(Vitamin C equivalent antioxidant capacity,VCEAC)表示[10]，以Vc质量浓度(x)为横坐标，Vc对DPPH自由基的清除率(y)为纵坐标作图得标准曲线，线性回归方程为：y=10.304x-0.088(R2=0.998 8)。

1.3.3ABTS自由基清除能力测定[10]将5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L的K2S2O8水溶液避光反应24 h后生成ABTS自由基。使用时先用无水乙醇稀释至734 nm处吸光度为1.00±0.02，稀释液当天使用。分别取稀释一定倍数的样品溶液200 μL，与4.8 mL ABTS稀释液混匀，避光反应15 min，以无水乙醇为对照，在波长734 nm处测定吸光度，空白以相同体积甲醇代替样品反应，按下式计算样品的ABTS自由基清除率：

式中：Ac为同体积甲醇代替样品反应的吸光度；Ai为样品反应的吸光度。

以Vc溶液为标准对照，测定不同质量浓度Vc对ABTS自由基的清除率，以Vc质量浓度(x)为横坐标，Vc对ABTS自由基的清除率(y)为纵坐标作图得标准曲线，线性回归方程为：y=6.278x-1.996(R2=0.998 1)。样品的ABTS自由基清除能力用Vc抗氧化当量(VCEAC)表示。

1.3.4Fe3+还原能力测定[11]分别取稀释一定倍数的样品溶液1 mL，加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6)混匀，再加入10 g/L的铁氰化钾溶液2.5 mL；50 ℃水浴恒温20 min后，加入100 g/L的三氯乙酸溶液1 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加去离子水2.5 mL以及1 g/L三氯化铁溶液0.5 mL，在波长700 nm处测定吸光度。用Vc溶液为标准对照，测定不同质量浓度Vc反应所得吸光度，以Vc质量浓度(x)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标作图得标准曲线，线性回归方程为：y=0.101x-0.006(R2=0.999 4)。样品还原Fe3+能力用Vc抗氧化当量(VCEAC)表示。

1.3.5总多酚含量的测定[12]以没食子酸为标准品，准确配制0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别吸取此标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL容量瓶中，依次加入Folin-Ciocalteu试剂2.0 mL和75 g/L的碳酸钠溶液2.0 mL，去离子水定容至10 mL，摇匀后显色反应2 h，在波长765 nm处测定吸光度。以没食子酸质量浓度(x，mg/mL)为横坐标，吸光度(y，A765 nm)为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=88.429x+0.001 (R2=0.999 4)。

将各样品稀释适当倍数，配成样品溶液，准确吸取各样品溶液100 μL，分别置于10 mL容量瓶中，按上述方法分别测定吸光度(A)，代入回归方程计算样品中的总多酚含量。

1.3.6总黄酮含量的测定[13]以芦丁为标准品，将芦丁于120 ℃干燥至恒质量，准确配制0.4 mg/mL的标准溶液，吸取此标准溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL于10 mL容量瓶中，加入50 g/L亚硝酸钠溶液0.5 mL混合均匀，放置6 min，然后加入100 g/L硝酸铝溶液0.5 mL混合均匀，放置6 min，最后加入40 g/L氢氧化钠溶液4 mL，蒸馏水定容，放置15 min，测定510 nm处吸光度。以芦丁质量浓度(x，mg/mL)为横坐标，吸光度(y，A510 nm)为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=12.324x+0.011 (R2=0.999 7)。

将各样品稀释适当倍数，配成样品溶液，准确吸取各样品溶液1 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按上述方法分别测定吸光度(A)，代入回归方程计算样品中的总黄酮含量。

1.3.7总抗氧化能力(T-AOC)的测定按照试剂盒说明进行测定，依据下述公式计算抗氧化值：

T-AOC值=

测试前稀释倍数。

式中：A测定为测定管吸光度；A对照为对照管吸光度。

1.4数据分析

2结果与分析

2.1不同枣饮品DPPH自由基清除能力的比较

图1为不同枣饮品DPPH自由基清除能力的Vc抗氧化当量(VCEAC)测定结果。由图1可以看出，不同枣饮品的DPPH自由基清除能力有极显著差异(P<0.01)。各样品的DPPH自由基清除能力由强到弱的顺序为：红枣乳酸发酵饮料>枣酒>原枣汁>枣酪饮料>酸枣汁饮料。其中红枣乳酸发酵饮料、枣酒DPPH自由基清除能力的Vc抗氧化当量分别为(223.8±2.4) mg/L和(158.6±1.7) mg/L。

由图1还可以看出，枣酒和红枣乳酸发酵饮料的DPPH自由基清除能力均较原枣汁的DPPH自由基清除能力有所提高，这说明不同微生物的发酵作用在不同程度上提高了原料的DPPH自由基清除能力。这可能是由于在微生物的作用下，红枣中的酚类物质发生了复杂的变化，使其结构、组成和含量随着发酵状态发生相应的改变。同时，不同的酚类物质对抗氧化能力的贡献也不尽相同[14]。调配型饮料(枣酪饮料和酸枣汁饮料)的抗氧化能力极显著低于原枣汁，这可能是由于在调配和物理加工过程中对枣的酚类物质破坏较大所致。

图 1　不同枣饮品DPPH自由基清除能力的比较

2.2不同枣饮品ABTS自由基清除能力的比较

图2是不同枣饮品对ABTS自由基清除能力的Vc抗氧化当量(VCEAC)测定结果。由图2可知，不同枣饮品对ABTS自由基的清除能力存在差异(P<0.05)。各饮品的ABTS自由基清除能力由强到弱的顺序为：红枣乳酸发酵饮料>枣酒>原枣汁>枣酪饮料>酸枣汁饮料。红枣乳酸发酵饮料的ABTS自由基清除能力极显著高于枣酒、原枣汁(P<0.01)，这可能是由于乳酸发酵使得红枣乳酸发酵饮料中的酚类物质含量增加，从而增强了该饮料的抗氧化能力。红枣乳酸发酵饮料、枣酒ABTS自由基清除能力的Vc抗氧化当量分别为(1 126.64±40.00) mg/L和(920.44±8.27) mg/L。

2.3不同枣饮品Fe3+还原能力的比较

图3是不同枣饮品Fe3+还原能力的Vc抗氧化当量(VCEAC)测定结果。

图 3　不同枣饮品Fe3+还原能力的比较

由图3可知，各种枣饮品的Fe3+还原能力存在差异，5种枣饮品的Fe3+还原能力由强到弱依次为红枣乳酸发酵饮料>枣酒>原枣汁>枣酪饮料>酸枣汁饮料。红枣乳酸发酵饮料的Fe3+还原能力极显著高于其他各种枣饮品(P<0.01)，其中红枣乳酸发酵饮料、枣酒的Fe3+还原能力的Vc抗氧化当量分别为(1 007.2±40.0) mg/L和(592.5±10.2) mg/L。这可能是由于乳酸发酵过程中酚类物质经过一系列复杂的变化后，所产生的新的酚类物质对Fe3+的还原能力较强，而酒精发酵的这种作用相对较弱。

2.4不同枣饮品总多酚和总黄酮含量的比较

不同枣饮品总多酚和总黄酮含量的测定结果见表1。由表1可以看出，不同枣饮品中总多酚和总黄酮含量存在差异，总多酚含量由高到低依次为红枣乳酸发酵饮料>枣酒>原枣汁>枣酪饮料>酸枣汁饮料，该顺序与DPPH自由基清除能力的顺序相同。红枣乳酸发酵饮料的总多酚含量极显著高于原枣汁(P<0.01)，枣酒与原枣汁中总多酚含量无显著差异(P>0.05)，而枣酪饮料和酸枣汁饮料中总多酚含量极显著低于原枣汁(P<0.01)。

表 1　不同枣饮品中总多酚和总黄酮含量的比较

注：同列不同大写字母表示差异达极显著水平(P<0.01)，不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

Note:Different capital letters in the table mean highly significant difference (P<0.01),and different small letters mean significant difference (P<0.05).

由表1还可以看出，5种枣饮品中总黄酮含量由高到低依次为红枣乳酸发酵饮料>原枣汁>枣酒>枣酪饮料>酸枣汁饮料，其中红枣乳酸发酵饮料的总黄酮含量极显著高于原枣汁(P<0.01)，而枣酒中总黄酮含量极显著低于原枣汁(P<0.01)，这可能是由于酚类物质在乳酸发酵过程中转化成黄酮类物质，在酒精发酵过程中部分黄酮类物质转化成其他酚类物质，从而使得红枣乳酸发酵饮料中总黄酮含量增加而枣酒中总黄酮含量减少。而枣酪饮料和酸枣汁饮料在调配或其他物理加工过程中黄酮类物质及酚类物质均会有一定程度的损失，从而使得这2款饮品中总多酚及总黄酮含量均较低。

2.5不同枣饮品总抗氧化能力的比较

由图4可知，不同枣饮料产品的总抗氧化能力有显著差异(P<0.05)。各饮料产品的总抗氧化能力由强到弱依次为红枣乳酸饮料>枣酒>原枣汁>枣酪饮料>酸枣汁饮料。这一顺序与各饮料DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、总多酚含量的顺序相同。由此可知，5种枣饮料中红枣乳酸发酵饮料的体外抗氧化能力最强，而枣酒的体外抗氧化能力次之，酸枣汁饮料的体外抗氧化能力最弱。

图 4　不同枣饮品总抗氧化能力的比较

2.6红枣乳酸发酵饮料不同发酵阶段抗氧化能力的变化

图5表示红枣乳酸发酵饮料在不同发酵阶段抗氧化能力(包括DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及Fe3+的还原能力)的变化趋势。由图5可以看出，在发酵初期(0～12 h)，发酵醪的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及Fe3+还原能力均有显著增强(P<0.05)，这可能是因为发酵初期由于浸渍作用红枣中的多酚类物质不断溶出，使得ABTS自由基清除能力开始增强；发酵12～48 h，在乳酸菌的作用下多酚类物质的组成和含量处于动态变化中，使得发酵醪对ABTS自由基的清除能力在总体上无显著变化(P>0.05)；发酵48 h后，多酚类物质在乳酸菌的作用下发生降解、重组等变化，又使得ABTS自由基清除能力得到不断增强。发酵醪的DPPH自由基清除能力和Fe3+还原能力在发酵12～72 h内无显著变化(P>0.05)，这可能是由于在乳酸发酵过程中，首先由于浸渍作用使得红枣中的酚类物质开始溶出，从而增强了发酵醪的DPPH自由基清除能力和Fe3+还原能力；随后在乳酸菌的作用下发酵醪的多酚类物质会发生一些动态变化，但这些变化在所测定时间内对DPPH自由基的清除能力和Fe3+还原能力的影响并不显著(P>0.05)。

2.7红枣乳酸发酵饮料中总多酚和总黄酮含量与抗氧化能力的相关性

将红枣乳酸发酵饮料4种抗氧化能力的Vc抗氧化当量(VCEAC)分别与其总多酚含量、总黄酮含量进行相关性分析，结果如表2所示。由表2可以看出，红枣乳酸发酵饮料的总多酚含量与其ABTS自由基清除能力、总抗氧化能力极显著相关(P<0.01)，与DPPH自由基清除能力、Fe3+还原能力显著相关(P<0.05)；红枣乳酸发酵饮料的总黄酮含量与其DPPH自由基清除能力、Fe3+还原能力极显著相关(P<0.01)，与ABTS自由基清除能力、总抗氧化能力显著相关(P<0.05)。由此说明多酚类物质、黄酮类物质对样品的抗氧化能力有显著影响(P<0.05)。

表 2　红枣乳酸发酵饮料的抗氧化能力与其总多酚及总黄酮含量的相关分析

注：**相关性极显著(P<0.01)，*相关性显著(P<0.05)。

Note:**means highly significant difference (P<0.01) and *means significant difference (P<0.05).

3结论与讨论

本研究比较了红枣乳酸发酵饮料与原枣汁、枣酒、酸枣汁饮料、枣酪饮料的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+还原能力、总多酚和总黄酮含量以及总抗氧化能力，结果表明：5种不同枣饮料的体外抗氧化能力存在显著差异(P<0.05)，其体外抗氧化能力的强弱顺序依次表现为：红枣乳酸发酵饮料>枣酒>原枣汁>枣酪饮料>酸枣汁饮料，而总黄酮含量有所不同，其由多到少的次序为：红枣乳酸发酵饮料>原枣汁>枣酒>枣酪饮料>酸枣汁饮料。枣酒中黄酮含量极显著低于原枣汁(P<0.01)，这可能是由于在酒精发酵过程中黄酮类物质被微生物分解为其他物质，从而使得总黄酮含量降低。在5种枣饮料产品中，红枣乳酸发酵饮料的体外抗氧化能力最强，枣酒次之，而未经过微生物发酵作用的枣酪饮料和酸枣汁饮料体外抗氧化能力均显著低于原枣汁(P<0.05)。由此可知，微生物的发酵作用能有效提高枣饮料的抗氧化能力。本研究中红枣乳酸发酵饮料的抗氧化能力显著高于枣酒(P<0.05)，这可能与不同微生物的发酵机理有关，不同微生物的发酵作用对于发酵醪中多酚类物质的结构、组成及含量可能具有不同的影响，同时微生物的中间代谢产物也可能对发酵醪的抗氧化性有所影响，但这种影响作用的机理还有待进一步研究。

在乳酸发酵的不同阶段，对红枣乳酸发酵饮料的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和Fe3+还原能力进行了监测，结果显示，在发酵0～12 h内，乳酸发酵醪的抗氧化活性随发酵时间的延长而显著增强(P<0.05)；在发酵12～72 h时，发酵醪的DPPH自由基清除能力和Fe3+还原能力均无显著变化(P>0.05)，而发酵醪对ABTS自由基的清除能力在12～48 h内无显著变化(P>0.05)，在48～72 h内随发酵时间的延长ABTS自由基清除能力不断增强。在发酵12 h时，红枣乳酸发酵饮料的抗氧化能力基本达到最大值，但此时其酸度较低，乳酸发酵特有的香气和口感还不明显；发酵48 h时，发酵醪液的体外抗氧化能力较发酵12 h的醪液无显著变化(P>0.05)，但口感更加丰富柔和，因此确定最佳的发酵时间为48 h。有研究表明，乳酸菌菌体表面的某些成分同样具有一定的抗氧化性，不同菌体表面的抗氧化性物质也不相同[15]。而本研究所选用的混合乳酸菌是否为高抗氧化活性菌株，是否对发酵醪的抗氧化性有一定的贡献，还有待于进一步研究。

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Antioxidant activity of jujube beverage fermented with lactic acid bacteria

JIN Yu-hong,LI Zhi-xi,QIAO Yan-xia,YANG Zhi,LI Rui,ZHANG Qiang

(CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The antioxidant activity of jujube beverage fermented with lactic acid bacteria (JBFLAB) was studied to provide reference for further development of JBFLAB.【Method】 The antioxidant properties of JBFLAB and its intermediate products in vitro (DPPH scavenging activity,ABTS+ scavenging activity, Fe3+reducing power and total antioxidant capacity) at different fermentation stages were investigated and compared with that of jujube wine,jujube juice without fermented,jujube yogurt juice,and wild jujube juice.【Result】 JBFLAB exhibited the highest antioxidant activities with DPPH,ABTS and reducing power VCEAC values of (223.8±2.4) mg/L,(1 126.64±40.00) mg/L,and (1 007.2±40.0) mg/L and total antioxidant capacity (T-AOC) of (56.98±0.41).JBFLAB was followed by jujube wine,which had VCEAC of (158.6±1.7) mg/L,(920.44±8.27) mg/L and (592.5±10.2) mg/L and T-AOC of (48.44±1.05).Juice of wild jujube showed the lowest antioxidant capacities with VCEAC of (81.9±0.7) mg/L,(30.67±1.07) mg/L and (156.2±10.5) mg/L,and T-AOC of (23.45±0.30).There was significant correlation between antioxidant capacity and total polyphenols content (P>0.05) in JBFLAB.The antioxidant capacity of JBFLAB increased significantly (P<0.05) at fermentation prophase (0-12 h).At 12-72 h,DPPH free radical scavenging activity and reducing power had no significant change (P>0.05).At 12-48 h,ABTS+ scavenging activity had no significant change at 12-48 h (P>0.05),but increased significantly (P<0.05) at 48-72 h. 【Conclusion】 JBFLAB not only had strong antioxidant capacity,but also had the unique aroma of lactic acid fermentation.It also tasted smooth and soft and merited development.

Key words:jujube;lactic acid fermentation;jujube beverage;antioxidant activity

[文章编号]1671-9387(2016)01-0199-07

[中图分类号]TS275.4

[文献标志码]A

[作者简介]靳玉红(1986-)，女，河北沧州人，在读硕士，主要从事微生物发酵研究。E-mail：xixiwangziyuhong@163.com[通信作者]李志西(1958-)，男，陕西临潼人，教授，博士，博士生导师，主要从事谷物功能食品及发酵食品研究。

[基金项目]陕西省农业科技创新项目(2012NKC02-02)

[收稿日期]2014-05-06

DOI：网络出版时间:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.029

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.058.html

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