丹酚酸B对大鼠缺血心肌组织溶酶体功能的影响

孙帅军　王新宇　黄小玲　陈叶香　王　曼　蒋宝平　许　立

(南京中医药大学药学院，江苏　南京　210023)



·基础研究·

丹酚酸B对大鼠缺血心肌组织溶酶体功能的影响

孙帅军王新宇黄小玲陈叶香王曼蒋宝平1许立1

(南京中医药大学药学院，江苏南京210023)

〔摘要〕目的探讨丹酚酸B(Sal B)对异丙肾上腺素(ISO)所致大鼠心肌缺血模型心肌溶酶体功能的影响。方法SD大鼠随机分为空白组，模型组，丹参注射液组和Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg组。除空白组外，各组大鼠尾静脉注射ISO建立急性心肌缺血模型，连续给药7 d后，PowerLab数据采集分析系统测定各组大鼠心电图变化;试剂盒测定血清中溶酶体相关膜蛋白2(Lamp-2)、组织蛋白酶D(Cat-D)的活性，心脏匀浆中一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、Cat-D和溶酶体匀浆中Cat-D的活性;HE染色法检测心肌梗死面积。结果与空白对照组比较(P<0.05或P<0.01)，模型组大鼠心电图T波水平显著升高，血清中Lamp-2、Cat-D的水平显著升高，心脏匀浆中NOS、NO、Cat-D含量升高，溶酶体匀浆中Cat-D含量降低，心肌梗死面积明显增多。Sal B 12.8、6.4 mg/kg组和丹参注射液组能够显著降低心电图T波升高值，降低血清lamp2、Cat-D和心脏匀浆中NOS、NO、Cat-D含量,升高心脏溶酶体匀浆Cat-D含量，与模型组比较(P<0.05或P<0.01)。结论Sal B对心肌缺血的保护作用与溶酶体的膜稳定性及水解酶的活性功能有一定的关系。

〔关键词〕丹酚酸B；心肌缺血；溶酶体；组织蛋白酶D

心肌缺血主要由血压降低、主动脉供血减少、冠状动脉阻塞等导致〔1〕。丹参注射液具有活血化瘀、通络止痛的功效，主要用于治疗冠心病心绞痛、心肌梗死等疾病〔2〕。丹酚酸B(Sal B)是丹参的水溶性有效成分，本课题组前期研究发现其对心肌缺血、动脉粥样硬化等疾病有保护作用，主要机制为抗氧化和清除自由基等〔3〕。心肌受损时，溶酶体在胞内发挥维持新陈代谢及细胞功能活性等作用。本实验主要探讨心肌受损时Sal B对大鼠急性心肌缺血的保护作用及与溶酶体功能的相关性。

1材料与方法

1.1药品与试剂Sal B(南京先慧医药工程研究有限公司，批号13091310)，异丙肾上腺素(ISO,sigma公司,批号Lot#SLBG3431V)，丹参注射液(正大青春宝药业有限公司,批号1309233)，氯化钠注射液(江苏亚邦生缘药业有限公司,批号13052402)，溶酶体相关膜蛋白2(Lamp-2)试剂盒、组织蛋白酶D(CatD)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号201505)。

1.2仪器Power-Lab 6.0数据采集分析系统(澳大利亚AD Instrument),FA1204B型分析天平(上海精科天美科学仪器有限公司)，Synergy HT型酶标仪(美国Bio-Tek公司)，CKX31型倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，Allegra 64R型冷冻离心机(美国Beckman-Coulter公司)。

1.3动物健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，60只，雌雄各半，体重180～220 g，采购自扬州大学实验动物中心〔SXCK(苏)：2014-0105〕。饲养在南京中医药大学实验动物中心，室温18℃～22℃，湿度50%～60%。

1.4实验方法将大鼠随机分为空白组，模型组，丹参注射液组，Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg组，每组10只。Sal B各组大鼠分别每日尾静脉注射Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg，连续7 d；丹参注射液组大鼠每日尾静脉注射丹参注射液4 000 mg/kg连续7 d，模型组和空白组每日给予等量生理盐水。各组以2 ml/kg体积尾静脉注射药物。末次给药后除空白组外，尾静脉注射ISO 5 mg/kg，2次/d，连续2 d。ISO造模后第3天，大鼠禁食不禁水12 h，描记描记大鼠1、3、5、10、15、20、30 min心电图(ECG)，记录S-T段的变化，若具备以下条件之一者判断为造模成功：①ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mV；②T波高耸超过同导联R波的1/2；③T波高耸伴ST段移位。心电图记录完毕后，颈动脉插管取血，于高速冷冻离心机3 000 r/min离心10 min，离心后取血清，-20℃冻存，备用。摘取心脏，石蜡包埋，切成4 μm石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色后显微镜下观察组织病理学变化。

1.5心肌酶学指标的检测取心脏，以冰生理盐水洗去残留血液，滤纸吸干后切下约2 mm的心尖部分，制成10%的生理盐水心肌组织匀浆，部分以3 000 r/min离心10 min，取上清-20℃冻存，备用。取部分心肌组织匀浆高速离心，2 500 r/min离心10 min分离出结构蛋白、细胞核、细胞碎片，7 200 r/min离心10 min分离出线粒体；13 000 r/min离心10 min分离出溶酶体，制备分离出溶酶体匀浆。取上清-20℃冻存，备用。按试剂盒操作说明测定心脏匀浆中NOS、NO、Cat-D和溶酶体匀浆中Cat-D的活性。

1.6统计学方法应用SPSS17.0软件，实验数据用x±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2结果

2.1一般情况观察空白组大鼠精神状态良好，饮食规律且正常，活动状况良好。模型组大鼠饮食较少，精神状态差。各用药组大鼠较模型组精神状态相对有所改善，食量基本正常，活动情况较模型组也有改善。

2.2ECG的检测空白组、丹参注射液组与模型组比较，1～30 min时间段内，各个不同的时间点T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。Sal B 12.8、6.4 mg/kg组与模型组比较，在3～20 min时间段，T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。Sal B 3.2 mg/kg组与模型组比较，在10、20 min处，T波抬高值均降低(P<0.05或P<0.01)。在其余各时间段Sal B 12.8、6.4、3.2 mg/kg组与模型组比较虽有降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。Sal B 12.8 mg/kg组与丹参注射液组作用相近。见表1。

表1Sal B对急性心肌缺血大鼠ECG T波抬高值的影响(x±s，n=10,mV)

组别剂量(mg/kg)即刻1min3min5min10min15min20min30min空白组-0.05±0.010.05±0.011)0.05±0.010.06±0.021)0.05±0.012)0.05±0.011)0.06±0.011)0.05±0.011)模型组-0.05±0.020.06±0.030.09±0.060.08±0.020.08±0.020.09±0.050.11±0.050.14±0.04丹参注射液组40000.04±0.010.05±0.021)0.05±0.011)0.05±0.012)0.05±0.012)0.05±0.011)0.05±0.021)0.06±0.012)SalB组12.80.05±0.010.05±0.010.04±0.011)0.05±0.012)0.05±0.012)0.05±0.020.06±0.031)0.06±0.012)SalB组6.40.05±0.020.05±0.020.05±0.021)0.05±0.022)0.05±0.012)0.05±0.011)0.05±0.022)0.10±0.02SalB组3.20.05±0.020.06±0.020.07±0.030.08±0.050.06±0.021)0.06±0.020.05±0.021)0.10±0.04

与模型组比较：1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

2.3血清酶学指标的检测空白组、丹参注射液组、Sal B 12.8、6.4 mg/kg组与模型组比较，血清中Lamp-2、Cat-D浓度显著下降(P<0.05或P<0.01)；Sal B 3.2 mg/kg组与模型组比较无显著性差异。见表2。

2.4心肌酶学指标的检测空白组、丹参注射液组、Sal B 12.8、6.4 mg/kg组与模型组比较，组织匀浆中NO、NOS浓度显著升高，Cat-D浓度显著下降，心脏溶酶体匀浆中Cat-D浓度显著升高(P<0.05或P<0.01)；Sal B 3.2 mg/kg组与模型组比较无显著性差异。见表2，表3。

表2Sal B对血清中Lamp-2、Cat-D含量的影响(x±s，n=10)

组别剂量(mg/kg)血清Lamp-2(pg/ml)Cat-D(ng/ml)心脏溶酶体匀浆Cat-D(ng/ml)空白组-0.13±0.022)3.45±2.352)35.93±3.752)模型组-0.17±0.0417.09±3.7929.29±6.24丹参注射液组40000.13±0.022)12.44±4.051)36.40±5.281)SalB组12.80.14±0.022)14.00±2.301)37.88±4.512)SalB组6.40.14±0.021)15.67±3.1531.78±4.59SalB组3.20.14±0.0216.06±3.3430.25±4.86

表3Sal B对心脏匀浆中NO、NOS、Cat-D含量的影响(x±s，n=10)

组别剂量(mg/kg)NOS(μmol/L)NO(μmol/L)Cat-D(ng/ml)空白组-28.47±1.252)28.56±4.312)3.45±2.352)模型组-19.96±1.1818.05±3.6817.09±3.79丹参注射液组400026.60±2.412)25.84±2.562)12.44±4.051)SalB组12.825.91±1.432)24.521±3.481)14.00±2.301)SalB组6.423.87±2.612)22.63±2.171)15.67±3.15SalB组3.222.09±1.551)20.26±3.9016.06±3.34

2.5Sal B对急性心肌缺血大鼠病理组织学的影响空白组大鼠心脏心肌细胞横纹清晰，未见增生肥大、萎缩、断裂，无细胞变性、坏死等病变，间质无水肿及炎性细胞浸润，心外膜、心内膜无异常；模型组8例心脏可见局灶性大量心肌纤维重度变性坏死、大量炎细胞浸润，余2例心脏可见局灶性心肌纤维变性坏死、中度炎细胞浸润；丹参注射液组9例可见局灶性心肌纤维轻度变性坏死、少量炎细胞浸润，1例局灶性心肌纤维变性坏死、中度炎细胞浸润；Sal B 12.8 mg/kg组8例心脏可见局灶性心肌纤维轻度变性坏死、少量炎细胞浸润，2例局灶性心肌纤维变性坏死、中度炎细胞浸润；6.4 mg/kg组3例心脏可见大量心肌纤维重度变性坏死、大量炎细胞浸润，7例局灶性心肌纤维变性坏死、轻中度炎细胞浸润；3.2 mg/kg组5例心脏可见大量心肌纤维重度变性坏死、大量炎细胞浸润，5例局灶性心肌纤维变性坏死、轻中度炎细胞浸润。见图1。

空白组、丹参注射液组、Sal B 12.8 mg/kg组与模型组比较，心肌纤维变性坏死、炎细胞浸润差异显著(P<0.05或P<0.01)。见表4。

图1　Sal B对急性心肌缺血大鼠病理组织学影响

表4Sal B对急性心肌缺血大鼠病理评分的影响(n，n=10)

组别剂量(mg/kg)心肌纤维变性坏死ⅠⅡⅢⅣ炎细胞浸润ⅠⅡⅢⅣ空白组2)-1000010000模型组000820082丹参注射液组2)400009100910SalB组2)12.808200820SalB组6.403430343SalB组3.202350235

3讨论

ECG中T波的上升程度以及ST波段的改变可以反映心肌缺血和心肌损伤的严重程度。Sal B可扩张冠状动脉，增加侧支循环、降低冠脉阻力，使其在心排出量不增加的前提下增加冠脉血流量、提高心肌血流量，改善缺血区的供血供氧，维持心脏作用〔4〕。本实验在注射ISO后，可明显发现T波上移、ST波段显著性下降；病理组织染色发现，ISO注射后心肌纤维重度变性坏死，明显空泡变性及大量炎性细胞浸润；而在给予Sal B 12.8、6.4 mg/kg后心电图T波变化、病理损伤有显著改善。

ISO诱导心肌受损，产生的氧自由基等引起血管内皮受损，从而抑制NOS活性。NO由NOS催化完成，通过抑制超氧阴离子和脂质过氧自由基所引起的过氧化损伤，对缺血后心功能的恢复及预后具有重要作用〔5〕。研究发现Sal B能够提高内皮细胞eNOS的表达，适度地活化iNOS，促进NO的合成〔6〕。本实验表明Sal B的心肌保护作用与氧自由基清除有关。

心肌受损产生过量的活性氧及自由基可诱发溶酶体膜通透性增加，影响溶酶体功能进而导致细胞死亡。溶酶体内含组织蛋白酶在内的多种高浓度酸性水解酶，这些水解酶可将与溶酶体融合的吞噬小泡所含的物质降解成小分子，从而维护机体的正常生理代谢〔7〕。心肌受损时，溶酶体在凋亡信号的作用下，激活溶酶体内Cat-D、Cat-B等水解酶的活性，通过减少细胞内炎症因子等，从而发挥保护细胞的功能〔8〕。Conus等〔9〕研究表明，细胞受损时，溶酶体释放了大量Cat-D、Cat-G等Cat，Cat-D通过激活caspase-8诱导中性粒细胞凋亡，减轻炎症反应。在心肌受损时，Cat-D等水解酶从细胞内的溶酶体内大量释放入胞外，因此，病理条件下Cat-D在组织和血清高表达。Lamps覆盖在溶酶体膜表面，是稳定溶酶体膜蛋白及膜结构完整性的重要蛋白〔10〕。番茄红素等能够对ISO所致的心肌受损大鼠发挥保护作用，认为其主要通过稳定溶酶体膜。保护溶酶体功能，进而发挥清除自由基、抗氧化等抗炎作用，保护心肌细胞〔11〕。Kreuzaler等〔12〕应用siRNA技术去除Lamp-2后溶酶体膜的通透性增加，导致溶酶体的完整性破坏和细胞的死亡。总之，本实验表明，Sal B对心肌缺血的保护作用与溶酶体的膜稳定性及水解酶的活性有关。

4参考文献

1许波华,许立.中药抗心肌缺血作用机制的研究进展〔J〕.中国实验方剂学杂志,2011;17(15):265-9.

2王之羽,王友群,李明.302例丹参注射液临床不良反应分析〔J〕.中国药房,2010;21(32):3035-7.

3许波华,沈祥春,张良,等.丹酚酸B对血管内皮细胞迁移及管腔形成的影响〔J〕.中国药理学通报,2012;28(4):496-500.

4高元峰,陈虎,王银辉.丹酚酸B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国药房,2013;24(43):4047-9.

5韩宇博,田苗,郭维毅,等.苓桂术甘汤预防性给药对心肌缺血再灌注损伤NO、NOS含量的影响〔J〕.中医药信息,2014;31(5):84-6.

6叶挺祥.丹酚酸B对血管内皮细胞NO合成的影响〔D〕.天津：天津大学硕士学位论文,2006.

7赵凯,卫涛涛.溶酶体与细胞凋亡〔J〕.生命科学,2011;23(11):1063-8.

8Nagoor-Meeran MF,Jagadeesh GS,Selvaraj P.Thymol attenuates inflammation in isoproterenol induced myocardial infarcted rats by inhibiting the release of lysosomal enzymes and downregulating the expressions of proinflammatory cytokines〔J〕.Eur J Pharmaco,2015;754(2):153-61.

9Conus S,Perozzo R,Reinheckel T,etal.Caspase-8 is activated by cathepsin D initiating neutrophil apoptosis during the resolution of inflammation 〔J〕.J Exp Med,2008;205(3):685-98.

10Nishino I,Fu J,Tanji K,etal.Primary LAMP-2 deficiency causes X-linked vacuolar cardiomyopathy and myopathy(Danon disease)〔J〕.Nature,2000;406(6798):906-10.

11Jyoti-Roy A,Stanely-Mainzen-Prince P.Preventive effects of p-coumaric acid on lysosomal dysfunction and myocardial infarct size in experimentally induced myocardial infarction〔J〕.Eur J Pharmaco,2013;699(1-3):33-9.

12Kreuzaler PA,Staniszewska AD,Li W,etal.Stat3 controls lysosomal-mediated cell death in vivo〔J〕.Nat Cell Biol,2011;13(3):303-9.

〔2015-12-25修回〕

(编辑袁左鸣)

Protective effects of salvianolic acid B on lysosomal dysfunction in isoproterenol induced myocardial ischemic rats

SUN Shuai-Jun，WANG Xin-Yu，HUANG Xiao-Ling，et al.

Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the protective effects of salvianolic acid(Sal) B on lysosomal dysfunction in isoproterenol induced myocardial ischemic rats.MethodsAll rats were randomly divided into control,model,Salvia miltiorrhiza injection and Sal B 12.8,6.4,3.2 mg/kg groups.The effects of Sal B on the electrocardiogram(ECG) at different time points were observed.The serum levels of lysosomal-associated membrane protein(lamp)-2 and cathepsin(cat)-D were measured.Also the levels of cat-D,nitric oxide(NO),nitric oxide synthase(NOS) in homogenate of myocardial tissue and cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue were tested.Meanwhile,the myocardial tissue pathological changes were observed.ResultsThe levels of Lamp-2 and Cat-D in serum,NOS,NO and Cat-D in homogenate of myocardial tissue of model group were increased;and the level of Cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue was reduced(P<0.05 or P<0.01) compared with those of control group.The contents of Lamp-2 and Cat-D in serum,NOS,NO and Cat-D in homogenate of myocardial tissue were decreased in Sal B 12.8,6.4 mg/kg and Salvia miltiorrhiza injection groups;and the level of Cat-D in lysosomal homogenate of myocardial tissue was increased compared with that of model group(P<0.05 or P<0.01).ConclusionsSal B has protective effects on myocardial ischemic rats,its mechanism might be related with the function of hydrolytic enzymes and lysosomal membrane stability.

【Key words】Salvianolic acid B;Myocardial ischemia;Lysosome;Cathepsin D

〔中图分类号〕R28

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1789-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.001

通讯作者：许立(1964-)，男，教授，硕士生导师，主要从事中药药理研究。

基金项目：国家十二五重大新药创制科技重大专项(No.2011ZX09102-002-07)

1江苏省中药药效与安全性评价重点实验室

第一作者：孙帅军(1989-)，男，硕士，主要从事中药药理研究。