电化学发光免疫测定25-羟基维生素D3在疾病预防控制中心的应用*

(北京市疾病预防控制中心，北京 100013)

李　红，沙怡梅，赵　耀△，施嘉琛

(北京市疾病预防控制中心，北京 100013)



·临床研究·

电化学发光免疫测定25-羟基维生素D3在疾病预防控制中心的应用*

(北京市疾病预防控制中心，北京 100013)

李红，沙怡梅，赵耀△，施嘉琛

(北京市疾病预防控制中心，北京 100013)

摘要:目的在疾病预防控制中心使用电化学发光免疫分析仪测定血清中25-羟基维生素D3。方法使用E-170电化学发光免疫分析仪测定25-羟基维生素D3并与使用酶免检测的数据进行比较。结果E-170电化学发光免疫分析仪测定25-羟基维生素D3质控血清检测结果均在1个标准差内；与酶免检测数据比较差异有统计学意义(P<0.05)，相关性差(r=0.568)。结论25-羟基维生素D3室内质控结果良好，可以使用E-170电化学发光免疫分析仪在疾病预防控制中心开展25-羟基维生素D3的检测工作，两种方法检测结果差异较大，在进行干预比较性实验时要注意使用的检测方法。

关键词:电化学发光免疫测定；25-羟基维生素D3；比对实验

维生素D是一种脂溶性维生素，最重要的两个形式是维生素D3(胆钙化甾醇)和维生素D2(麦角钙化甾醇)[1]。维生素D是脂溶性甾体激素前体，其本身并没有生物活性，在体内肝脏和肾脏经过连续两步的羟基化反应过程变成为具有生物活性的1,25-二羟基维生素D[2]。检测血清中25-羟基维生素D有95%以上的为25-羟基维生素D3，当服用维生素D2补充剂时可达到25-羟基维生素D2检测水平。在人体内循环中的25-羟基维生素D的半衰期为2～3周，维生素D的水平和人体健康息息相关，与儿童佝偻病、骨质疏松症、帕金森病、心血管疾病、高血压、慢性肾脏病、2型糖尿病、干燥综合征、过敏性鼻炎、肿瘤等疾病的研究大量被报道[3-12]。观察不同纬度阳光照射、营养状况等因素对人体维生素D水平的影响，通过改善生活习惯、饮食结构从而使维生素D水平达到正常。在以往的检测工作中酶免方法使用较多，使用E-170电化学发光免疫分析仪在疾病预防控制中心开展25-羟基维生素D3检测。

1材料与方法

1.1仪器设备E-170电化学发光免疫分析仪,罗氏诊断产品(上海)有限公司。

1.2试剂、校准品和质控品E-170电化学发光免疫分析仪配套使用试剂、标准品和质控品由罗氏诊断产品(上海)有限公司。

1.2.2校准品和质控品25-羟基维生素D3校准品货号03314855， 4×1 mL。质控品货号11972227，水平1和2各有(2×2)mL。

1.2.3系统附件系统缓冲液ProCell M，(2×2)L，货号04880340。检测池清洗液CleanCell M，(2×2)L，货号04880293。货号03023141，PC/CC-Cups，12杯，使用前预热ProCell M和CleanCell M。货号03005712，ProbeWash M,12×70 mL洗液，用于更换试剂和检测完毕后的冲洗。货号12102137，48盒×84反应器或移液头，废物袋。

1.3检测原理25-羟基维生素D3检测试剂盒使用的是抗维生素D3多克隆抗体，采用竞争法，样品总检测时间为18 min。反应过程需要进行两次孵育，首先灰色盖R1生物素标记的维生素D与血清(35 μL)中的维生素D3发生竞争反应，黑色盖R2生物素-维生素D/钌复合物标记的多克隆特异性维生素D3抗体复合物与该生物素标记的维生素D结合。反应体系中免疫复合物的剩余量和样本中分析物的浓度有关。第2次孵育是在体系中添加透明盖M链霉亲和素包被的微粒后，生物素与链霉亲和素的相互作用使形成的免疫复合体结合到固相。将反应混合物吸入测量池，通过磁性微粒吸附到电极表面。加入ProCell系统缓冲液将没有结合物质除去。对电极加压之后产生化学发光，光电倍增器开始测定发光的强度计算样品结果。

1.4实验方法将试剂组放入E-170分析仪试剂仓(20 ℃)，通过试剂条码仪器自动读取测试具体参数。定标：25-羟基维生素D3试剂组带有一个含有各批号试剂定标具体信息的条码标签，使预定义的主曲线适用于分析仪。质控：检测质控血清水平1和2进行室内质量控制，质控血清检测结果符合要求后检测标本。计算：根据在分析仪上2点定标产生的定标曲线和试剂条码提供的主曲线判定，分析仪自动计算出各样本中被测物浓度(ng/mL或nmol/L)。实验检测数据使用ng/mL浓度单位。换算因子：nmol/L×0.40=ng/mL；ng/mL×2.50=nmol/L。

1.5统计学处理采用SPSS16.0软件包进行统计学分析，实验数据进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1E-170电化学发光免疫分析仪上质控品检测结果见表1。

表1　质控品检测结果(ng/mL)

2.2相关性分析两种检测方法结果比较差异有统计学意义(P=0.00，t=6.885),相关性差(r=0.568)，检测结果见表2。

表2　两种方法结果比较(n=256,ng/mL)

3讨论

两个水平的质控品检测结果均在1个标准差内，结果良好符合要求。使用前分析仪器会自动对磁性微粒进行再混匀，不同浓度范围的质控品单独测定，至少要在开始测试后每24 h一次、每个试剂盒一次和在每次定标后一次。制订实验室的质控间隔和限值,所检测值应在规定的限值内。另外，试剂说明书指出该方法的溯源性，本方法已经过LC-MS-MS法标准化，可以使用E-170电化学发光免疫分析仪开展25-羟基维生素D3的检测工作。与酶免检测数据比对结果差别有统计学意义，这与张弘等[13]报道的一致。美国临床实验室标准协会(CLSI)EP9-A2文件的要求是r≥0．975(或r2≥0.95)[14]，两种检测方法相关性差(r=0.568)。目前国内检测维生素D的方法并不统一，结果有很大差异[15-19]。在疾病预防控制中心或者妇幼保健院等根据营养状况监测并进行补充改善的工作[20]，在进行干预前后、进行比较性实验时要注意使用的检测方法。

E-170电化学发光免疫分析仪配套使用试剂M(透明盖)、R1(灰色盖)、R2(黑色盖)组成25-羟基维生素D3试剂组，竖直存放于2～8 ℃冰箱保存，以确保使用前自动混合过程中微粒完全有效。轻拿轻放避免试剂起泡。为了避免因试剂瓶盖过紧在操作时错误报警，在放入试剂仓之前可手工分别把3瓶试剂盖轻轻打开再轻轻合上。仪器设备试剂盘内温度为20 ℃左右，为了保证试剂稳定性检测之前放入，不能长期放在试剂仓内。为了避免运行过程中异常停机，开机之前准备好系统试剂及倒掉废弃物，并且按照医疗废弃物严格处理。

在试剂说明书中还有一些内容需要注意，检测25-羟基维生素D3标本使用带分离凝胶的血清：在18～25 ℃稳定8 h，2～8 ℃能稳定4 d，-20 ℃可稳定6个月。K3-EDTA抗凝血浆：18～25 ℃可以稳定8 h，2～8 ℃稳定4 d，-20 ℃稳定6个月。肝素-锂抗凝血浆：18～25 ℃能稳定8 h，2～8 ℃稳定1 d，肝素-锂抗凝的血浆禁止冷冻。试剂检测范围：4～100 ng/mL或者10～250 nmol/L。低于检测下限时报告值为小于4 ng/mL(<10 nmol/L)。超出测量范围上限时报告值为大于100 ng/mL(>250 nmol/L)，超出测量范围的样本可进行人工稀释后在测定。在开展检测工作之前认真仔细阅读试剂说明书对保证检测结果的准确是很必要的。

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(收稿日期：2016-01-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.039

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)09-1247-03

*基金项目：卫生公益性行业科研专项(201202012)。△通讯作者，E-mail：zhaoyao@bjcdc.org。