血小板表面相关抗体检测对ITP的诊断作用研究

曾明　程樱　钱婷　侯伶俐

430000　武汉市，湖北省临床检验中心(曾明、钱婷);湖北省食品药品监督检验研究院(程樱)；湖北省十堰市太和医院(侯伶俐)



·论著·

血小板表面相关抗体检测对ITP的诊断作用研究

曾明程樱钱婷侯伶俐

430000武汉市，湖北省临床检验中心(曾明、钱婷);湖北省食品药品监督检验研究院(程樱)；湖北省十堰市太和医院(侯伶俐)

【摘要】目的研究血小板表面相关抗体检测对特发性血小板减少性紫癜(ITP)的诊断作用研究。方法选取2012年1月至2013年1月收治的ITP患者50例(A组)，非免疫性血小板减少患者20例(B组)，其他自身免疫性疾病患者20例(C组)，另征集20名健康志愿者作为D组。测定4组血小板膜糖蛋白Ⅱb-Ⅲa(PAC-1)以及血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM水平，对ITP患者进行病情分级，并对治疗后进行疗效评定，统计各个分级的ITP患者及不同疗效患者血小板相关抗体阳性率。结果4组PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平差异有统计学意义(P<0.05)。A组PAIgA、PAIgG、PAIgM均明显高于其他3组患者(P<0.05)。ITP 1、2、3级患者PAIgA、PAIgG、PAIgM阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着ITP分级升高，患者PAIgA阳性率呈升高趋势(r值分别为0.712、0.614、0.732，P<0.05)。显效、进步、无效组患者PAIgA阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，且随着治疗效果的改善，PAIgA阳性率呈降低趋势(r=0.642，P<0.05)。显效、进步、无效组患者PAIgG、PAIgM阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着疗效改善，患者PAIgG阳性率呈升高趋势(r值分别为0.723和0.721，P<0.05)。结论ITP患者血小板表面相关抗体较正常人有所升高，且血小板相关抗体高低与病情程度有一定的相关性，有助于临床ITP的诊疗。

【关键词】血小板表面相关抗体；ITP；PAIgA、PAIgG、PAIgM

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种常见的出血性疾病，以血小板减少为主要特征。ITP在育龄期女性发病率高于男性，其他年龄阶段男女比例无差别[1-3]。根据持续时间可分为新诊断、持续性(持续时间在3～12个月)及慢性(持续时间≥12个月)。ITP患者常隐匿起病，病前无明显的病毒感染或其他疾病史，病程较长，部分患者可终身患病。由于患者血小板减少，患者常有全身散在的皮肤出血点，部分患者可伴有轻度出血症状，如鼻衄、牙龈出血等，其中紫癜及瘀斑常见于下肢及上肢远端[4-6]。血小板相关抗体是诊断出血性疾病的条件之一，有研究表明，90%左右的特发性血小板减少性紫癜患者血小板相关抗体增高，包括PAIgG、PAIgA、PAIgM等[7]。随着医学技术的不断提高以及分子生物学领域的不断深入研究，关于血小板相关抗体与出血性疾病的研究不断开展，但关于血小板相关抗体在ITP患者的诊断作用的研究尚缺乏。为此，我院对90例出血性疾病患者以及20名健康患者进行研究，报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取湖北省十堰市太和医院自2012至2013年收治的ITP 50例(A组)，非免疫性血小板减少患者20例(B组)，其他自身免疫性疾病患者20例(C组)，另征集20名健康志愿者作为D组，参与研究。其中A组中，男24例，女26例；年龄7～48岁，平均年龄(37±16)岁；病程3～8年，平均病程(5±4)年。B组中，男11例，女9例；年龄36～49岁，平均年龄(39±15)岁；病程2～8年，平均病程(5±4)。C组中，男12例，女8例；年龄8～47岁，平均年龄(37±16)岁；病程3～7年，平均病程(5±3)年。D组中，男10例，女10例；年龄7～48岁，平均年龄(36±15)岁。排除标准：本身有严重呼吸、循环系统疾病无法保证本研究顺利进行者；对本研究所用药物过敏者；严重感染或者患有HIV、乙肝等传染病患者；依从性差，不能配合医护人员实施操作者；入院前进行血小板输注治疗或者使用免疫抑制剂进行治疗者。以上患者均二次确诊，其中ITP患者诊断标准参考中华医学会儿科学分会血液学组1998年公布的ITP诊疗建议(修订草案)进行。4组患者性别比、年龄、病程等具有可比性。患者及家属知情并同意本次研究。

1.2方法

1.2.1ITP治疗方法：对ITP患者采用醋酸泼尼松龙注射液20～40 mg/d或长春新碱2 mg/m2，1次/周进行免疫抑制剂治疗，经免疫治疗无效的ITP患者予以脾切除治疗。

1.2.2血小板相关抗体测定：测量前嘱患者禁食12 h，采集2组患者空腹静脉血5～10 ml。采用离心法分离血小板抗体，转速设定为800 r/min，离心5 min，得到富含血小板血浆，加入等量磷酸盐缓冲液———牛血清血蛋白清洗液(PBS-BSA)，去除上清液后，再加PBS-BSA清洗液2 ml，以2 500 r/min离心5 min，去上清液。重复操作3次，获得血小板液，4℃条件保存待用。

1.2.3用流式细胞分析技术测定PAIg(PAIgG、A及M)表达水平和血小板计数：分别将上述分离所得血小板悬液50 μl与FITC-IgG(羊抗人)/CD61-PE、FITC-IgM(羊抗人)/CD6l-PE、FITC-IgA(羊抗人)/CD61-PE、FITC-IgG(羊抗鼠)/CD61-PE抗体各10 μl。充分混匀，于室温下避光孵育3 min，PBS-BSA清洗液清洗，并用流式细胞分析仪检测。

1.2.4血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa检测方法：全血标本置于室温放置2 h或4℃过夜后于离心20 min，取上清液作为样品，采用上海一研生物科技有限公司生产的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa检测试剂盒操作说明书对试剂盒中的要求，配置样品稀释液、检测稀释液、检测溶液剂底物溶液、洗涤液、终止液等。在酶标仪器板非别设置设空白孔、标准孔、待测样品孔，分别将配置好的样品加入相应孔内，覆膜，37℃反应120 min，再向每内加检测溶液工作液 100 μl，37℃,60 min。温再洗板，加工作液，温育60 min，洗板，底物溶液90 μl，37℃避光显色，肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度兰色，后3～4孔梯度不明显，终止。终止溶液50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。理解采用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)并计算浓度。

1.3评价标准

1.3.1疗效标准：参考中华医学会儿科学分会血液学组制定的疗效评定标准：①治愈：出血消失,血小板数>100×109/L,持续2年无复发者；②有效：出血消失,连续3次血小板计数>50×109/L,或较原水平升高值>30×109/L,持续时间达2个月以上者；③进步：出血减轻,血小板数有所上升,持续时间不足2月者；④无效：治疗4周未达标准者。

1.3.2按照国际儿童工ITP研究组2006年提出的分级标准兼顾血小板和出血情况,进行分级：1级：轻度,生活状态正常,极少的出血点和小的疲斑,偶尔鼻出血,按压后可停止,口腔内无血泡,无其他出血,PLT：(10～150)×109/L；2级：中度,生活状态有干扰,很多新的出血点和大的疲斑(直径>5 cm),反复鼻出血时间>15 min,尽管按压可止血,反复牙跟、口腔、嘴唇、咽部或消化道出血,月经过多,血便、血尿、咳血,PLT：(10～20)×109/L；3级：重度,危及生命,广泛的出血点和大的瘀斑,持续牙跟、口、咽部出血,怀疑内出血(肺、脑、肌肉、关节、其他),PLT：<10×109/L。

2结果

2.14组PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平比较4组患者PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平差异有统计学意义(P<0.05)。A组PAIgA、PAIgG、PAIgM均明显高于其他3组患者(P<0.05)其中C组PLT水平与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表14组患者PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平比较

组别PLT(×109/L)PAC-1(%)PAIgA(%)PAIgG(%)PAIgM(%)A组(n=50)46±2246±1743.3±0.548±2053.3±0.5B组(n=20)24±15*12±4*25.2±0.5*20±12*32.2±0.5*C组(n=20)42±2210±4*32.3±0.5*27±15*42.3±0.5*D组(n=20)148±24*12±6*13.5±0.5*9±4*23.5±0.5* F值11.3210.337.428.229.09 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：与A组比较，*P<0.05

2.2ITP分级患者血小板相关抗体阳性率比较ITP 1、2、3级患者PAIgA阳性率分别为3例(21.5%)、5例(26.4%)、9例(52.9%)，3组患者PAIgA阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着ITP分级升高，患者PAIgA阳性率呈升高趋势(r=0.712，P<0.05)。ITP 1、2、3级患者PAIgG阳性率分别为9例(42.8%)、13例(68.4%)、12例(70.6%)，3组患者PAIgG阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着ITP分级升高，患者PAIgG阳性率呈升高趋势(r=0.614，P<0.05)。ITP 1、2、3级患者PAIgM阳性率分别为5例(35.7%)、8例(42.1%)、8例(47.1%)，3组患PAIgM阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着ITP分级升高，患者PAIgM阳性率呈升高趋势(r=0.732，P<0.05)。见表2。

表2　各ITP分级患者血小板相关抗体阳性率比较　例(%)

2.3ITP分级患者血小板相关抗体阳性率比较3组患者PAIgA阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着治疗效果的改善，患者PAIgA阳性率呈降低趋势(r=0.642，P<0.05)。显效、进步、无效组患者PAIgG阳性率分别为20例(76.9%)、19例(82.6%)、19例(90.5%)，3组患者PAIgG阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着疗效改善，患者PAIgG阳性率呈升高趋势(r=0.723，P<0.05)。显效、进步、无效组患者PAIgM阳性率分别为5例(19.2%)、8例(34.7%)、14例(66.7%)，3组患PAIgM阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着疗效改善，患者PAIgM阳性率呈升高趋势(r=0.721，P<0.05)。见表3。

表3　各ITP分级患者血小板相关抗体阳性率比较　例(%)

3讨论

ITP是一种常见的出血性疾病，以不明原因的血小板减少为主要表现特征，患者可有全身性紫癜以及轻度出血症状[8,9]。当血小板在血液循环中遇到相对应的抗体时，抗原抗体会产生反应[10-12]。由于免疫介导作用，血小板将会被单核-巨噬细胞吞噬。这个过程不但大大缩短了血液循环中血小板的寿命，甚至会严重影响患者血小板的数量，引起出血性疾病。目前研究较多的血小板相关抗体主要有三种，分别为PAIgA、PAIgG、PAIgM。临床数据表明，多数ITP患者血小板相关抗体有一定程度的升高[13]。IgM是分子量最大的Ig，也称为巨球蛋白，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。同时，IgM也是早期感染的重要指标之一，在免疫应答时，在三种抗体中出现最早，但持续时间较其他两种抗体短。PAIgM具有很强的补体激活能力，一份子IgM抗体便可以激活补体，引起相关反应链。PAIgM还有较强的细胞膜溶解能力，在血小板凋亡过程中具有重要作用。IgA在正常人血清中的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10%～20%。IgA具有IgG以及IgM的部分功能，但在免疫反应中并不起重要作用。新生儿出生4～6个月后，血中可出现IgA，到青少年期达到高峰。因此，幼儿ITP患者IgA较成人低，可无明显升高。儿童ITP属良性疾病，除了少数重度血小板减少患者可并发颅内出血之外，病死率不到1%[14]。而成人ITP自发缓解者很少，约1/3的患者对激素及脾切除无效，这些患者常常迁延不愈，约5%的患者可死于颅内出血。因此，及早诊断对患者预后具有重要作用。随着分子生物学技术的不断发展，关于ITP患者血液血小板表面抗体的研究逐渐开展。为此，本院对90例出血性疾病患者以及20名健康志愿者进行研究，并取得了一定的成果。

文中结果显示，特发性血小板减少性紫癜患者PAIgA 、PAIgG、PAIgM均明显高于其他3组患者(P<0.05)。提示特发性血小板减少性紫癜患者相关抗体均明显升高，且与其他出血性疾病有所差异。与Seymour等[15]结果相似。ITP 1、2、3级患者PAIgA、PAIgG、PAIgM阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着ITP分级升高，患者PAIgA阳性率呈升高趋势(r值分别为0.712、0.614和0.732，P<0.05)。显效、进步、无效组患者PAIgA阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着治疗效果的改善，患者PAIgA阳性率呈降低趋势(r=0.642，P<0.05)。显效、进步、无效组患者PAIgG、PAIgM阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。且随着疗效改善，患者PAIgG阳性率呈升高趋势(r值分别为0.723和0.721，P<0.05)。这与Talaat等[16]结果相似。提示PAIgA、PAIgG、PAIgM与ITP患者病情呈正相关，患者ITP病情程度越重，PAIgA、PAIgG、PAIgM越高。

综上所述，ITP患者血小板表面相关抗体较正常人有所升高，且血小板相关抗体高低与病情程度有一定的相关性，有助于临床ITP的诊疗。

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15Seymour LA,Nourse JP,Crooks P,et al.The presence of KIR2DS5 confers protection against adult immune thrombocytopenia.Tissue Antigens,2014,83:154-160.

16Talaat RM,Elmaghraby AM,Barakat SS,et al.Alterations in immune cell subsets and their cytokine secretion profile in childhood idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).Clinical and Experimental Immunology,2014,176:291-300.

The significance of detection of platelet surface associated antibodies in diagnosis of ITP

ZENGMing*,CHENGYing,QIANTing*,etal.

*HubeiProvincialClinicalLaboratoryCenter,Wuhan430000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the significance of detection of platelet surface associated antibodies in diagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).MethodsThe subjects in the study were divided into four groups,including 50 patients who were treated in our hospital from January 2012 to January 2013 in group A,20 patients with non immune thrombocytopenia in group B,20 patients with the other autoimmune diseases in group C,moreover, the 20 healthy subjects were served as control group (group D). The levels of platelet membrane glycoprotein Ⅱb-Ⅲa (PAC-1), platelet associated antibodies including PAIgG,PAIgA,PAIgM were detected in the four groups, and the pathogenetic condition of patients with ITP was graded.After treatment the therapeutic effects were evaluated, furthermore, the positive rates of platelet surface associated antibodies were statistically analyzed.ResultsThere were significant differences in the levels of PLT,PAC-1, PAIgA,PAIgG,PAIgM among the four groups (P<0.05). The levels of PAIgA,PAIgG,PAIgM in group A were significantly higher than those in the other three groups (P<0.05). There were significant differences in the positive rates of PAIgA,PAIgG,PAIgM among patients with ITP at grade 1,2,3(P<0.05).Moreover with the increase of ITP grading,the positive rates of PAIgA of patients with ITP were increased (r=0.712,0.614,0.732,respectively,P<0.05). There were significant differences in the positrive rates of PAIgA among excellence group,improvement group, inefficiency group (P<0.05),furthermore,with the improvement of therapeutic effects,the positive rates of PAIgA were significantly decreased (r=0.642,P<0.05).There were significant differences in the positive rates of PAIgG,PAIgM among excellence group, improvement group, inefficiency group (P<0.05),furthermore,with the improvement of therapeutic effects,the positive rates of PAIgG were obviously increased (r=0.723,0.721,respectively,P<0.05).ConclusionThe platelet surface associated antibodies in patients with ITP are increased,moreover, which are correlated to the degree of pathogenetic condition,thus which are helpful for the diagnosis and treatment of ITP.

【Key words】platelet surface associated antibodies; ITP; PAIgA; PAIgG; PAIgM

(收稿日期：2015-11-10)

【中图分类号】R 554.6

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)10-1494-04

通讯作者：程樱,430000武汉市，湖北省食品药品监督检验研究院;

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.015

E-mail:xxrbzgdkj62970@126.com