乳腺癌中CDC25A和P57kip2蛋白表达与病理分级及临床分期的关系

张文静

430100　湖北省武汉市蔡甸区中医医院检验科



·论著·

乳腺癌中CDC25A和P57kip2蛋白表达与病理分级及临床分期的关系

张文静

430100湖北省武汉市蔡甸区中医医院检验科

【摘要】目的探讨CDC25A和P57kip2蛋白在乳腺癌中的表达与病理分级、临床分期的关系，并对CDC25A和P57kip2之间的相关性进行研究。方法选择免疫印迹方法对64例乳腺癌患者进行检测，对CDC25A和P57kip2 蛋白在乳腺癌中的表达、病理特征以及临床分期三者之间的联系进行确切的研究探讨。结果乳腺癌以及癌细胞周围的正常细胞中都能够找CDC25A蛋白的表达，但在乳腺癌中则表现为高密度表达(P<0.05)；肿瘤的分化程度越低，CDC25A蛋白的表达逐渐提升(P<0.05)。CDC25A 蛋白表达在临床Ⅰ期、Ⅱ期，是否伴有淋巴结转移间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。P57kip2蛋白在乳腺癌中呈低水平表达，在癌旁正常腺体中均呈高表达(P<0.05)，但在伴和不伴淋巴结转移中差异无统计学意义(P>0.05)。结论CDC25A的过度表达和P57kip2的低表达可能在乳腺癌的发生中起作用；乳腺癌发生机制中有涉及细胞周期调节环路中的CDC25A、P57kip2基因的异常；CDC25A及P57kip2可能成为乳腺癌的诊断标记，预后判断。

【关键词】乳腺癌；细胞分裂调控25磷酸酶A；P57kip2蛋白；免疫印迹

目前笔者尚未发现国内有关CDC25A及P57kip2与乳腺癌之间关系的相关报道，但研究表明P57kip2阻止底物磷酸化，将细胞阻滞于G1期，抑制细胞增殖，而CDC25A能消除Thr-14和Tyr-15的抑制性磷酸化，促进G1/S期的进行，对细胞的运转起正性调控作用[1-3]。乳腺癌的发生发展是一个长时间、多步骤、多阶段并涉及多基因改变的逐步演进的过程，其发生发展需多个基因的异常，而在此过程中是否存在CDC25A 及P57kip2的功能紊乱，其具体机制尚不明确[4,5]。为此，本研究采用免疫印迹法(westorn blot)为实验平台，检测乳腺癌组织、癌旁正常乳腺腺体组织中CDC25A及P57kip2的表达情况，并分析它们与乳腺癌病理分级、临床分期、淋巴结转移等临床病理因素之间的关系，探讨其在乳腺癌发生发展中的影响以及它们之间的相互作用关系。

1资料与方法

1.1一般资料收集我院2011年9月至2012年6月64例乳腺癌(标本经病理证实)患者的组织标本，患者均为原发性肿瘤，术前均未接受过放化疗。64例均为女性，年龄38～81 岁，平均年龄(51±5)岁。肿瘤组织按癌细胞的分化程度(WHO 病理分级)分为Ⅰ级(n=7)、Ⅱ级(n=48)、Ⅲ级(n=9)3个试验组；淋巴结转移：无转移29 例，有转移35 例；按国际抗癌联盟(UICC)分期：Ⅰ期11 例，Ⅱ期34 例，Ⅲ期19 例。对照组中属于癌细胞旁的正常腺体组织，然后随机选择之后作为乳腺改良根治手术以后的病例标本，大约距离肿瘤3 cm以上的乳腺腺体组织标本10 例(经病理证实为正常乳腺腺体)。取材后置入-80℃冰箱保存备用。

1.2试剂与仪器

1.2.1抗体：兔抗人CDC25A 多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；兔抗人P57kip2多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；兔抗人 β-actin (武汉博士德生物工程有限公司)；硝酸纤维素膜(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2.2仪器：蛋白电泳仪(DYCZ-24D 型)；核酸电泳仪(北京六一公司)；流式细胞仪(FCM，becton dickinson 公司)；凝胶电泳成像分析系统(alphainnotech chemi imager,美国)；DYY-4OB 型转印电泳槽(北京六一仪器厂)；可见-紫外分光光度计(U-2000，Hitachi 公司，Japan)；硝酸纤维素膜电转系统(Bio-Rad 公司)。

1.3试验方法

1.3.1Western blot法：对64 例乳腺癌组织和10 例癌旁正常腺体，均选取50 mg组织，冰上将组织置于10 ml离心管中,用消毒过的剪刀将组织块尽量剪碎。参照文献[5]方法进行操作用酶标仪测定A562，根据标准曲线来计算样品的蛋白浓度。

1.3.2SDS-PAGE电泳：参照文献[5]方法进行操作，然后利用显影技术进行定影处理，并对最终的结果进行详细的观察研究，并利用图像采集系统对图像进行收集。

2结果

2.1CDC25A 蛋白在各组中的表达及其与乳腺癌的关系对于全部的组织来说，都具有CDC25A 蛋白的表达，但是在乳腺癌组织中则表现为高水平的表达，且在乳腺癌各病理分级，Ⅰ期、Ⅱ期，伴或不伴淋巴结转移间的表达差异有统计学意义(P<0.05)；在Ⅱ期，Ⅲ期分期间吸光度定量分析差异无统计学意义(P>0.05)。CDC25A蛋白在乳腺癌组织中各病理分级间的表达差异有统计学意义(P<0.05)，且CDC25A在乳腺癌组织及癌旁正常腺体组织相比差异有统计学意义(P<0.05)；对于癌细胞旁的正常腺体组织以及乳腺癌组织中的CDC25A蛋白来说，其Ⅰ期和Ⅱ期的表达差异有统计学意义(P<0.05)，但在Ⅱ期、Ⅲ期分期间吸光度定量分析差异无统计学意义(P>0.05)；CDC25A蛋白在有或无淋巴结转移的乳腺癌组织和癌旁正常腺体组织的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

表1　CDC25A在乳腺癌组织各病理分级和对照组的表达　±s

注：与对照组比较，*P<0.05；与Ⅰ级(期)比较，#P<0.05；与无淋巴结转移比较，△P<0.05

各病理分级间的表达

按UICC的TNM分期间的表达

伴或不伴腋窝淋巴结转移的表达

图1CDC25A 和β-actin 蛋白在癌旁正常腺体组织和乳腺癌中各病理分级间、UICC的TNM分期间、伴或不伴腋窝淋巴结转移的表达

2.2P57kip2蛋白在各组中的表达和乳腺癌的关系P57kip2蛋白在癌旁正常乳腺组织中大量表达，在乳腺癌组织中呈低表达，且在乳腺癌各病理分级，分期的表达差异较明显，在伴或不伴腋窝淋巴结转移间吸光度定量分析差异不明显。P57kip2蛋白在乳腺癌组织中各病理分级间的表达差异明显，且P57kip2在癌细胞的正常腺体以及乳腺癌组织中相比较可以发现，两者之间差异有统计学意义(P<0.05)；P57kip2蛋白乳腺癌组织中各临床分期中的表达差异有统计学意义(P<0.05)；P57kip2蛋白在有或无淋巴结转移的乳腺癌组织和癌旁正常腺体组织的表达差异有统计学意义(P<0.05)，但在乳腺癌组织中有或无淋巴结转移间吸光度定量分析差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2。

表2　P57kip2在各组织中的表达及乳腺癌的关系　±s

注：与对照线比较，*P<0.05；与Ⅰ级(期)比较，#P<0.05

图2P57kip2和β-actin 蛋白在癌旁正常腺体组织和乳腺癌中各病理分级间、UICC的TNM分期间、伴或不伴淋巴结转移的表达

3讨论

本研究显示，在乳腺癌中CDC25A的表达显著高于癌旁正常腺体组织，CDC25A蛋白在癌旁正常腺体组织中和乳腺癌组织中各病理分级及临床分期中Ⅰ期、Ⅱ期的表达存在正相关，CDC25A蛋白在癌旁正常腺体组织中，有或无淋巴结转移的乳腺癌组织中同样存在正相关，这都进一步证实CDC25A的过表达与乳腺癌发生和早期的发展息息相关，并且过表达提示预后不良，或者是预后不良的危险因素之一，Ⅱ、Ⅲ期的表达差异无统计学意义(P>0.05)，可能提示CDC25A只在乳腺癌发展的早期起作用，在中晚期的作用不明显，也有可能还需要更多更大范围的实验研究来进一步证实[6-8]。

在本研究中显示，在乳腺癌中P57kip2蛋白的表达显著低于癌旁正常腺体组织，P57kip2蛋白乳腺癌组织中各临床分级中及癌旁正常腺体组织中的表达存在负相关，P57kip2蛋白乳腺癌组织中各临床分期中及癌旁正常腺体组织中的表达亦存在负相关，这些都进一步证实P57kip2的缺失与乳腺癌发生发展有密切关系，并且缺失提示预后不良或者是预后不良的危险因素之一，至于为什么在有或无淋巴结转移中相比较并无明显差异，可能提示P57kip2只在乳腺癌的发生发展的早期起作用，在进一步浸润中的作用不明显，或者到了部分晚期乳腺癌组织中P57kip2开始扮演促进肿瘤浸润和转移的作用，当然也有可能还需要更多更大范围的实验研究来进一步证实乳腺癌发生淋巴结转移后P57kip2的作用。

总之，在本研究中可以看出乳腺癌发生机制中有涉及细胞周期调节环路中的CDC25A、P57kip2基因的异常，而且两者在整个乳腺癌发生发展中起着完全相反的作用，我们从中分析，可以大胆猜测CDC25A的过度表达可能和P57kip2的低表达在乳腺癌发生中起协同作用。当然进一步得证实还有赖于更多标本的收集及更多实验的论证。

P57kip2蛋白的功能实现依靠两种途径，一是抑制CDK复合物，二是抑制PCNA即细胞核增生抗原[9,10]。本文结果表明CDC25A和P57kip2能够一起组合成细胞调节通道，主要是在细胞周期中，这一通道的形成和乳腺癌的发生以及发展有重大联系。

本文中的所有研究中能够发现，CDC25A蛋白在所有检测的组织中都有表达，使癌旁正常腺体和乳腺癌组织进行比较，其在CDC25A的表达方面差异有统计学意义(P<0.05)。尤其是在乳腺癌组织中，CDC25A高度表达，乳腺癌的病理分级程度不同表达也不同，肿瘤分化程度越高，CDC25A的表达越低，在Ⅰ级到Ⅲ级表达逐渐降低；CDC25A在乳腺癌组织中的表达比癌旁正常腺体中的表达明显升高。从试验结果中可以看出，乳腺癌的发生与发展过程离不开CDC25A蛋白的作用，它可以导致癌细胞增殖，还和肿瘤的病理分化程度有正相关关系，在临床癌症疾病的分期中与Ⅰ期、Ⅱ期也成正相关关系，同样与其有正相关关系的还有淋巴结转移。如果检测出CDC25A蛋白表达程度高，则表示预后效果不佳。在癌旁正常腺体的组织中能够检测到大量P57kip2蛋白，但是在乳腺癌组织中检测出的P57kip2蛋白就比较低，在肿瘤的Ⅰ级到Ⅲ的分级中，肿瘤分化程度不断降低的，P57kip2蛋白的表达也逐渐降低，并且与肿瘤的病理分化程度及临床分期均呈负相关。提示P57kip2的缺失可能参与了乳腺癌的演变过程。由于CDC25A的过度表达、P57kip2的丢失均是通过共同的Rb途径参与乳腺癌的发生与发展。由此我们可以推断：P57kip2蛋白能够被当作一种新抑癌基因，细胞恶性增殖可能会导致P57kip2蛋白表达缺失[11-13]。P57kip2蛋白在乳腺癌中呈低水平表达，在癌旁正常腺体中均呈高表达，P57kip2的低表达与乳腺癌的分化程度密切相关，肿瘤从Ⅰ级到Ⅲ级其分化程度逐渐降低，表达也逐渐降低，这和乳腺癌大小，临床分期也密切相关，肿瘤越大，分期越晚，P57kip2表达就越低。P57kip2在乳腺癌的发生发展中可能还扮演着一个抑癌基因的角色，其表达的缺失可能参与了乳腺癌的演变过程[14,15]。

综上所述，CDC25A的过度表达和P57kip2的低表达可能在乳腺癌的发生中起作用；乳腺癌发生机制中可能有涉及细胞周期调节环路中的CDC25A、P57kip2基因的异常；CDC25A及P57kip2可能成为乳腺癌的诊断标记，预后判断。

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Correlation between expressions of P57kip2and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer

ZHANGWenjing.

DepartmentofClinicalLaboratory,TCMHospitalofCaidianDistrict,Wuhan430100,China

【Abstract】ObjectiveTo investigatre the correlation between expressions of P57kip2 and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer,and to explore the relationship between CDC25A and P57kip2.MethodsThe expression levels of CDC25A and P57kip2protein were detected by Western Blot in 64 cases of breast cancer,then the correlation between expressions of P57kip2and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer was analyzed.ResultsThe expression of CDC25A protein counld be found in breast cancer cells and normal cells surrounding cancer cells,however,which was high-expressed in breast cancer (P<0.05),in addition to that,the lower differentiation degrees of tumor,the higher expression levels of CDC25A protein (P<0.05).There were significant differences in the expression levels of CDC25A protein among clinical stageⅠ,stage Ⅱ,with lymph node metastasis,without lymph node metastasis (P<0.05).The expression levels of P57kip2protein were decreased,however,which were increased in normal gland tissues beside cancer (P<0.05).ConclusionThe overexpression of CDC25A and low-expression of P57kip2may play an important role in the pathogenesis of breast cancer.The pathogenesis of breast cancer may be related with the gene abnormality of CDC25A,P57kip2,which may become markers in diagnosis and prognosis judgment of breast cancer.

【Key words】breast carcinoma;cell division control 25 phosphatases A; P57kip2 protein;Western Blot

(收稿日期：2015-10-17)

【中图分类号】R 737.9

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)10-1471-04

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.008

项目来源：湖北省自然科学基金资助项目(编号：2014CDB06802)