4种杀菌剂对葡萄霜霉病菌的毒力及田间防效

吉沐祥，吴祥，陈宏州，杨敬辉，庄义庆，姚克兵，李国平（江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容212400）

4种杀菌剂对葡萄霜霉病菌的毒力及田间防效

吉沐祥，吴祥，陈宏州，杨敬辉，庄义庆，姚克兵，李国平
（江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容212400）

摘要：为探明黄麻链霉菌NF0919菌株和枯草芽孢杆菌DJ-6对葡萄霜霉病的生防活性，采用叶盘法分别测定黄麻链霉菌NF0919发酵上清液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP、代森锰锌和烯酰吗啉对葡萄霜霉病菌的室内毒力，并进行防治葡萄霜霉病的田间试验。结果表明：NF0919菌株发酵上清液、1.0× 1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP、代森锰锌和烯酰吗啉对葡萄霜霉病菌孢子萌发抑制的EC50值分别为96.2859、86.6038、69.9472、7.2636 μg/mL。NF0919菌株发酵20倍液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP1000倍液对葡萄霜霉病做预防性施药时，2次药后7天的防效分别为71.55%和70.71%，2次药后14天的防效分别为67.54%和68.19%；当做治疗性施药时，2次药后7天的防效分别为59.72%和56.07%，2次药后14天的防效分别为56.88%和57.46%。2种供试生防菌剂的防效相当，且保护效果与50%代森锰锌WP 300倍液均差异不显著，而治疗效果与40%烯酰吗啉SC 200倍液均差异显著。可见，黄麻链霉菌NF0919菌株和枯草芽孢杆菌DJ-6 WP对葡萄霜霉病具有一定的生防潜力与开发的价值。

关键词：黄麻链霉菌NF0919菌株；枯草芽孢杆菌DJ-6；葡萄霜霉病；生防活性

0　引言

由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的葡萄霜霉病(grape downy mildew)是葡萄生产中的第一大病害[1-2]，可造成大面积减产，是现阶段制约葡萄产业发展的一大瓶颈[3]。目前，该病害主要为化学药剂，常用的药剂有波尔多液、百菌清、甲霜灵、霜脲氰、代森锰锌、嘧菌酯、霜霉威、烯酰吗啉、吡唑醚菌酯和68.75%氟吡菌胺·霜霉威盐酸盐（商品名为银法利）等药剂单剂或复配剂[4-7]。国内最初引进甲霜灵防治卵菌病害时，忽视了该药属于高抗药风险药剂，未与多作用位点的保护性杀菌剂混用，导致甲霜灵使用2～3年后葡萄霜霉菌对其普遍产生抗药性[8]。当前，多种化学药剂的抗药性风险不能忽视[9-12]，特别是近几年，化学农药造成的食品安全事件、农药残留超标事件时有发生，人们对生物农药的期盼越来越高。生物农药具有安全、有效、容易降解、不易产生抗性以及对人畜环境毒性小等特点，与保护生态环境和食品安全生产要求相吻合。因此，果品生产中也迫切需要以生物防治为主的病虫害绿色防控技术。

笔者采用叶盘法分别测定了黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液、枯草芽孢杆菌DJ-6 WP、代森锰锌和烯酰吗啉对葡萄霜霉病菌的室内毒力，并进行防治葡萄霜霉病的田间试验，旨在研发葡萄霜霉病的生物防控技术。

1　材料与方法

1.1供试菌株

黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)NF0919菌株（菌株保藏号为CGMCC No.3968，菌株专利号为ZL 201010236886.1），由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所现代农业研究室提供[13]。

1.2供试药剂

黄麻链霉菌NF0919菌株经发酵后，收集发酵上清液，置于4℃冰箱中备用[14]。1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP（农药试验证号SY201200899），江苏丘陵地区镇江农业科学研究所研制，江苏绿盾植保农药实验有限公司加工。将该药剂用无菌水配制成10000 μg/mL的母液置于4℃冰箱中备用。

96%代森锰锌、50%代森锰锌WP，利民化工股份有限公司；98%烯酰吗啉，山东盛帝化工销售有限公司；40%烯酰吗啉SC，陕西先农生物科技有限公司。分别将96%代森锰锌和98%烯酰吗啉用适量吡啶和丙酮溶解后再加入无菌水，并加入1%的吐温-80做乳化剂，均配制成10000 μg/mL的母液置于4℃冰箱中备用。

1.3室内毒力活性测定

1.3.1孢子悬浮液的配制2014年5月，从江苏丘陵地区镇江农业科学研究所内的‘夏黑’葡萄上采集田间自然发病的叶片，用无菌水冲洗病叶表面的孢子囊后，将病叶置于25℃条件下保湿24 h来培养新鲜的孢子囊，然后收集新孢子囊并将孢子囊浓度调整至1.0×106个/mL置于4℃冰箱中备用。

1.3.2药剂浓度设计分别将黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP、代森锰锌和烯酰吗啉的浓度设计为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625 μg/mL；均为2倍稀释的8个不同浓度梯度，以无菌水为对照。

1.3.3接种方法采用叶盘法[15-16]，采集‘夏黑’葡萄健康新稍的4～6位叶片，并在叶片的叶脉间用打孔器制取直径1.5 cm的叶盘，将10µL 1.0×106个/mL的葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液接种于叶盘中央。每处理20个叶盘，重复4次，置于培养箱内在25℃，湿度80%，光照12 h/d条件下培养7天后，调查发病情况。

1.3.4统计方法病情调查采用6级记载法[17]，调查病级后计算病情指数以及各药剂不同浓度对葡萄霜霉病菌孢子萌发的抑制率。采用DPS数据处理系统，计算出各药剂抑制葡萄霜霉病菌孢子萌发的毒力回归方程和抑制中浓度(EC50)，并以代森锰锌的EC50值为对照求出相对毒力指数。病情指数和抑制率计算如式(1)～ (2)。

病情指数=[Σ(各级发病叶盘数×相应级数值)/总叶盘数×9]×100………………………………………(1)

抑菌率=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%………………………………………(2)

1.4田间药效试验

1.4.1试验点概况试验在江苏丘陵地区镇江农业科学研究所内的葡萄园进行。葡萄园内地势平坦，土壤为下蜀马肝土，pH 6.8左右，有机质含量1.45%。供试品种为‘夏黑’。葡萄树龄7年，为篱架式栽培，栽培管理水平良好，当季内未使用其他相关药剂。

1.4.2试验设计分别设NF0919菌株发酵上清20倍液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP 1000倍液、50%代森锰锌WP 300倍液（推荐剂量）和40%烯酰吗啉SC 200倍液（推荐剂量）喷雾防治，以清水喷雾为对照，试验3次重复，小区面积30 m2，用水量为600 kg/hm2。

表1　供试药剂对葡萄霜霉病菌的室内毒力测定结果

表2　供试药剂对葡萄霜霉病的田间防效

保护性施药：在田间有极少量葡萄叶片发病但供试植株无发病叶片时施药，2014年5月5日第1次施药；10天后第2次施药；分别调查2次药后7、14天病指。

治疗性施药：在供试葡萄植株叶片零星发病时施药，2014年6月3日调查药前病指，并第1次施药；10天后第2次施药；分别调查2次药后7、14天病指。病情调查及药效计算方法参照农药田间试验准则[17]。

1.4.3安全性调查安全性调查方法参照农药田间试验准则[17]。

2　结果与分析

2.1室内毒力测定结果

室内毒力测定得出，NF0919菌株发酵上清液、1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP、代森锰锌和烯酰吗啉对葡萄霜霉病菌孢子萌发抑制的EC50值分别为96.2859、86.6038、69.9472、7.2636 μg/mL。以代森锰锌的EC50值为对照得出，NF0919菌株发酵上清液、1.0× 1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP和烯酰吗啉的相对毒力指数分别为1.3766、1.2381、0.1038。烯酰吗啉对霜霉病菌孢子萌发的抑制活性最强，NF0919菌株发酵上清液的抑制活性最低。NF0919菌株发酵上清液以及枯草芽孢杆菌DJ-6 WP对霜霉病菌孢子萌发的抑制的EC50值和代森锰锌的EC50值分别相差约为1.4、1.2倍（表1）。这表明，2种供试的生防菌剂对葡萄霜霉病菌孢子的萌发具有一定的抑制活性，但抑制活性均略低于代森锰锌，而明显低于烯酰吗啉。

2.2田间药效试验结果

田间试验结果得出：当在田间有零星发病（试验植株无发病叶片）做保护性施药时，2次药后7、14天，黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清20倍液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP 1000倍液对葡萄霜霉病的防效相当，且均略低于50%代森锰锌WP 300倍液的防效，但差异不显著；2次药后7、14天，NF0919发酵上清液20倍液和枯草芽孢杆菌DJ-6 WP1000倍液对葡萄霜霉病的防效均低于40%烯酰吗啉SC 200倍液的防效，且差异显著。当在田间普遍开始发病做治疗性施药时，2次药后7、14天，NF0919发酵上清液20倍液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP 1000倍液的防效相当，但防效均低于50%代森锰锌WP 300倍液和40%烯酰吗啉SC 200倍液的防效，且差异显著（表2）。这表明，NF0919菌株发酵上清液和枯草芽孢杆菌DJ-6 WP在防治葡萄霜霉病均有一定的效果，且保护效果与保护性杀菌剂代森锰锌相当，而治疗效果较差。

2.3安全性调查

经目测观察，试验区域内葡萄生长发育正常，没有发生药害，表明供试药剂在试验剂量范围内对葡萄安全。

3　结论

本研究得出，自主研发的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液和枯草芽孢杆菌DJ-6 WP对葡萄霜霉病菌孢子萌发均具有一定的抑制活性，且抑制活性均略低于保护性杀菌剂代森锰锌，但明显低于治疗性杀菌剂烯酰吗啉。NF0919菌株发酵上清20倍液和1.0× 1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP 1000倍液对葡萄霜霉病的防效相当，且保护效果与保护性杀菌剂代森锰锌在推荐剂量下喷施时的防效无显著差异，但治疗效果较差，并且明显低于代森锰锌和治疗性杀菌剂烯酰吗啉的防效。因此，笔者认为黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液和枯草芽孢杆菌DJ-6 WP在防治葡萄霜霉病时，可作预防性的喷雾防治。

4　讨论

目前葡萄霜霉病的防治主要依赖化学防治[18]，由于化学防治的昂贵投入及其导致的环境公害迫使人们寻求新的防治途径[19]。近年来，葡萄霜霉病的生物防治是研究热点之一。陈浩等[20]报道，枯草芽孢杆菌B-FS01无论在室内还是在田间，对葡萄霜霉病菌均具有优良的防效。岳宪化等[21]报道，哈茨木霉菌可湿性粉剂对葡萄霜霉病具有较好的防效。扈进冬等[22]报道，多粘类芽孢杆菌PB-2对葡萄霜霉病具有较好的防效，有希望开发成为一种可有效防治葡萄霜霉病的生防制剂。藏超群等[23]报道，生防细菌SY286对葡萄霜霉病菌具有较强的抑菌作用，并有望使其在葡萄霜霉病的生物防治中发挥更大潜能。杨泓威等[24]报道，植物源农药丁子香酚是防治黄瓜疫霉病的优良杀菌剂。李宝燕等[25]报道，丁子香酚、苦参碱、多抗霉素和小檗碱可作为防控葡萄霜霉病的有效生物药剂使用。但在当前葡萄生产实际中，对霜霉病具有高效稳定防效的生防制剂还鲜有报道。

本研究中笔者采用叶盘法分别测定了自主研发的生防菌剂——黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP以及生产中常用的杀菌剂——代森锰锌和烯酰吗啉对葡萄霜霉病菌孢子萌发的抑制活性，结果表明4种供试杀菌剂的毒力大小顺序为烯酰吗啉>代森锰锌>枯草芽孢杆菌DJ-6 WP>NF0919菌株发酵上清液，内吸治疗性杀菌剂烯酰吗啉的毒力最强，2种供试生防菌剂的毒力略低于保护性杀菌剂代森锰锌，可见2种供试生防菌剂对葡萄霜霉病菌孢子萌发具有一定的抑制活性。需指出的是，黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液和枯草芽孢杆菌DJ-6 WP对葡萄霜霉病菌的作用机理还有待进一步研究，因而该方法测定的室内毒力仅能作为药剂效价的参考。

在田间实际应用时，黄麻链霉菌NF0919菌株发酵上清液和1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6 WP对葡糖霜霉病均具有一定的防治效果，且保护效果优于治疗效果。目前上述自主研发的2种生防菌剂均已初步开发成为制剂，枯草芽孢杆菌DJ-6 WP已进入农药登记的田间试验阶段。

参考文献

[1]李海强.石河子地区葡萄霜霉病的发生规律及防治研究[D].新疆:石河子大学,2009:2.

[2]Pal Mieri M C, Perazzolli M, Matafora V, et al. Proteomic Analysis of Grapevine Resistance Induced by Trichoderma harzianurn T39 Reveals specific Defence Pathways Activated against Downy Mildew[J]. J Exp Bot,2012,63(17):6237-6251.

[3]王忠跃.中国葡萄病虫害与综合防控技术[M].北京:中国农业出版社,2009:3-4.

[4]张松强,王立如.田间药剂防治葡萄霜霉病的效果[J].安徽农学通报,2007,13(12):169-170.

[5]Cadle-Davidson L.Variation within and between Vitis spp. for foliar resistance to the downy mildew pathogen plasmoparaviticola[J]. Plant disease,2008,92(11):1577-1584.

[6]朱卫刚,胡伟群,刘燕君,等.新型杀菌剂嘧菌酯对葡萄霜霉病室内生物活性评价[J].中国南方果树,2011,40(4):80-81.

[7]李艳琼.5种杀菌剂对葡萄霜霉病的控制效果[J].甘肃农业大学学报,2011,46(6):62-65.

[8]毕秋艳,马志强,韩秀英,等.葡萄霜霉病菌对甲霜灵抗药性治理及其田间抗药菌株遗传稳定性分析[J].植物病理学报,2014,44(3): 302-308.

[9]Gisi U,Chin K M,Knapova G,et al.Recent developments in elucidating modes of resistance to phenylamide,DMI and strobilurin fungicides[J].Crop Protection,2000,19:863-872.

[10]Benign M,Bompeix G.Postharvest control of Phytophthora cryptogea of witloof chicory with different fungicides and possible occurrence of resistant strains[J].Crop Protection,2006,25(4):350-355.

[11]罗彦平,王强,刘琳,等.新疆葡萄霜霉病对4种杀菌剂的敏感性研究[J].新疆农业科学,2013,50(5):851-856.

[12]李宝燕,王英姿,刘学卿,等.3种杀菌剂对葡萄霜霉病菌的毒力测定和田间药效试验[J].江苏农业科学,2014,42(1):98-99.

[13]杨敬辉,文平兰,陈宏州,等.放线菌NF0919的鉴定及生防活性[J].西北农业学报,2013,22(4):201-206.

[14]陈宏州,庄义庆,杨敬辉.黄麻链霉菌NF0919菌株对草莓枯萎病菌的生防活性初探[J].江西农业学报,2014,26(11):54-57.

[15]Tooly P W,Sweigard J A,Fry w E,et a1.Fitness and virulence of Phytophthora infestans isolates fromsexual populations[J]. Phytopathology,1986,76:1209-1212.

[16]方中达.植病研究方法(第3版)[M].北京:中国农业出版社,1998:60.

[17]农业部农药检定所.农药田间药效试验准则(二):杀菌剂防治葡萄霜霉病药效试验准则[M].北京:中国标准出版社,2000:234-238.

[18]廉俊平,张引平.浅谈葡萄霜霉病的发生与防治[J].农业技术与装备,2011(4):34-35.

[19]李兴红,燕继晔.葡萄病虫害防治关键技术[M].北京:中国农业出版社,2012:60.

[20]陈浩,胡梁斌,唐春平,等.枯草芽孢杆菌B-FS01对葡萄霜霉病的防治效果[J].植物保护,2011,37(6):194-197.

[21]岳宪化,胡夫防,段丽峰,等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病试验[J].中国果树,2014(2):54-56.

[22]扈进冬,吴远征,李纪顺,等.拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2及其制剂对葡萄霜霉病的防效测定[J].山东农业科学,2014,27(3):30-33.

[23]藏超群,赵奎华,刘长远,等.生防菌株SY286对葡萄霜霉病菌的抑菌效果[J].沈阳农业大学学报,2014,45(2):221-224.

[24]杨泓威,易图水,雷颖.丁子香酚对黄瓜疫霉菌的室内毒力测定[J].湖南农业科学,2012(3):68-69.

[25]李宝燕,王培松,王英姿.葡萄霜霉病的生物药剂防治[J].农药,2014, 53(11):853-855.

Toxicity Test and Field Control Effect of 4 Different Fungicides on Grape Downy Mildew

Ji Muxiang, Wu Xiang, Chen Hongzhou, Yang Jinghui, Zhuang Yiqing, Yao Kebing, Li Guoping
(Zhenjiang Institute of Agricultural Science, Jurong 212400, Jiangsu, China)

Abstract:To investigate the biocontrol activity of Streptomyces corchorusii strain NF0919 and Bacillus subtilis DJ-6 WP to grape downy mildew, we determined the indoor toxicity of the supernatant of S. corchorusii strain NF0919, 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP, mancozeb and dimethomorph on Plasmopara viticola by using leaf disc method, respectively, and the field control tests were conducted. The results showed that the EC50values of the supernatant of strain NF0919, 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP, mancozeb and dimethomorph were 96.2859, 86.6038, 69.9472 and 7.2636 μg/mL, respectively. The values of field control effect in preventive experiments on grape downy mildew on the 7th day after 2 times spraying with 20 times liquid of the supernatant of strain NF0919 and 1000 times liquid of 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP were 71.55% and 70.71%, and the values of field control effect on the 14th day after 2 times spraying were 67.54% and 68.19%, respectively. The values of field control effect in curative experiments on the 7th day after 2 times spraying with 20 times liquid of the supernatant of strain NF0919 and 1000 times liquid of 1.0×1011cfu/g B. subtilis DJ-6 WP were 59.72% and 56.07%, the values of field control effect on 14th day after 2 times spraying were 56.88% and 57.46%, respectively. The field control effect of the two kinds of the tested biocontrol agents was equivalent. The protective effect between each of the tested biocontrol agents and 300 times liquid of 50% mancozeb WPhad no significant difference, but there were significant differences of the efficacy between each of the tested biocontrol agents and 200 times liquid of 40% dimethomorph SC. In conclusion, the S. corchorusii strain NF0919 and B. subtilis DJ- 6 WP had certain biocontrol potential to grape downy mildew and value of development. Key words: Streptomyces corchorusii Strain NF0919; Bacillus subtilis DJ-6; Grape Downy Mildew; Biocontrol Activity

中图分类号：S482.2

文献标志码：A论文编号：cjas15060026

基金项目：江苏省农业科技自主创新项目“江苏丘陵地区葡萄主要病害高效安全防控技术研究”[CX(14)2056]；镇江市科技支撑计划项目“提高苏南丘陵地区应时鲜果生产市场竞争力的品种和技术的集成示范”(NY2013024)。

第一作者简介：吉沐祥，男，1963年出生，江苏宝应人，研究员，本科，主要从事果树植保与农药研究开发工作。

通信地址：212400江苏省句容市弘景路1号江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，Tel：0511-80978086，E-mail：jilvdun2800@163.com。 212400江苏省句容市弘景路1号江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，Tel：0511-80978006，E-mail：jrlgp@126.com。

通讯作者：李国平，男，1962年出生，江苏武进人，研究员，推广硕士，主要从事果树与丘陵农业资源开发利用研究。

收稿日期：2015-06-30，修回日期：2015-09-06。