苦参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激和细胞凋亡的影响

陈树杰

(河北省邯郸市中心医院,河北 邯郸 056001)



苦参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激和细胞凋亡的影响

陈树杰

(河北省邯郸市中心医院,河北 邯郸 056001)

[摘要]目的研究苦参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激和心肌细胞凋亡的影响。方法将120只雄性SD大鼠随机分为假手术组，模型组，苦参素低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组和地尔硫卓(1 mg/kg)组；除假手术组外，其余各组大鼠均通过夹闭冠状动脉30 min后松夹的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型；再灌注后各给药组立即通过腹腔注射给药，每天1次，连续7 d，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。末次给药后，生化分析法测定血清谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)水平；通过TTC染色法测定心肌梗死面积，通过苏木精-尹红(HE)染色观察心肌组织病理形态学改变；测定心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，总抗氧化能力(T-AOC)水平以及丙二醛(MDA)含量；通过原位细胞凋亡检测(TUNEL)法观察心肌细胞凋亡状况并计算凋亡指数；通过免疫组织化学(IHC)法检测心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达情况并进行半定量分析，计算bcl-2/bax比值。结果苦参素中、高剂量组大鼠血清AST、CPK、LDH水平明显低于模型组(P均<0.05)，心肌梗死面积明显小于模型组(P均<0.05)；心肌组织中SOD活性显著高于模型组(P均<0.05)， MDA含量显著低于模型组(P均<0.05)，其中苦参素高剂量组GSH-Px活性和T-AOC水平均显著高于模型组(P均<0.05)。各给药组大鼠心肌组织病变不同程度改善，其中以苦参素高剂量组效果最为显著；各给药组大鼠心肌细胞凋亡状况明显好转，苦参素中、高剂量组凋亡指数明显低于模型组(P均<0.05)；苦参素中、高剂量组大鼠心肌组织中bcl-2表达量和bcl-2/bax比值明显高于模型组(P均<0.05)，bax表达量明显低于模型组(P均<0.05)。结论苦参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激损伤和心肌细胞凋亡具有抑制作用；作用机制可能与其能够改善抗氧化酶活性、促进抑制凋亡蛋白bcl-2表达、抑制促凋亡蛋白bax表达并提高bcl-2/bax比值有关。

[关键词]苦参素；心肌；缺血再灌注；氧化应激；凋亡

苦参素(Oxymatrine，OMT)是从中药苦参(Sophora flavescens Ait.)中提取的一种喹诺西啶类生物碱，其具有抗炎、抗病毒、抗细胞凋亡、抗肝纤维化等多种生物学活性[1-3]，对肾脏、肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用[4-5]，但其是否对体外心肌细胞缺氧复氧损伤具有保护作用尚不明确。本实验通过夹闭冠状动脉30 min后松夹恢复血流再灌注的方法制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，研究苦参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1实验资料

1.1试验药物与试剂苦参素(南京泽朗医药科技有限公司，批号：20141025，纯度≥98%)；注射用盐酸地尔硫卓(天津田边制药有限公司，批号：1408026)；红四氮唑(TTC)(美国Sigma公司)；谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL检测试剂盒(北京博奥森科技有限公司)；bcl-2、bax免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2实验动物清洁级雄性SD大鼠，8周龄，体质量220～260 g，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，动物合格证号：201411012。饲养环境：室温23～25 ℃，相对湿度60%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3主要仪器DH-150型动物人工呼吸机(浙江大学医学仪器有限公司)；wi93962生物机能实验系统(北京北瑞达医药科技有限公司)；BS-300全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；UV762型紫外可见分光光度计(上海楚定分析仪器有限公司)；BI-2000医用图像分析系统；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)。

1.4动物分组与模型制作将120只SD大鼠随机分为假手术组，模型组，苦参素低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组和地尔硫卓(1 mg/kg)组各20只。除假手术组大鼠外，其余各组大鼠均参照徐叔云等[6]报道的实验方法制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型：腹腔注射乌拉坦实施麻醉，通过肢体二导联心电图监测心功能；气管切开后插管并连接动物呼吸机(参数设置：频率60次/min，潮气量20 mL/kg，呼吸比1.5∶1)，稳定10 min后打开胸腔，剪开心包暴露心脏，于左心耳下缘约2 mm处夹闭冠状动脉，心电图示ST段抬高或T波高耸表示心肌缺血；30 min后松开动脉夹恢复血流灌注，抬高的ST段降低或高耸的T波得以恢复表示心肌再灌注成功；假手术组行手术通路，除不夹闭冠状动脉外，其余操作与模型组完全一致。再灌注后，各给药组立即腹腔注射给药，每天1次，连续7 d，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。

1.5观察项目

1.5.1血清AST、CPK、LDH水平测定末次给药后24 h，麻醉后开腹经腹主动脉取血，经1 500 r/min离心10 min后取血清，按照各试剂盒操作步骤，通过全自动生化分析仪平行测定各种大鼠血清AST、CPK、LDH水平。

1.5.2心肌梗死面积的测定取血完成后，每组随机取5只开胸取心脏组织，-20 ℃冻存20 min后进行切片处理，然后于37 ℃环境中通过1%TTC溶液避光孵育15 min后，正常组织呈红色、梗死区呈灰白色，然后通过BI-2000医用图像分析系统计算心肌组织梗死面积。

1.5.3心肌组织病理形态观察每组随机取5只大鼠，参照1.5.2方法，摘取心脏组织，经过4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)和展片处理后，进行常规HE染色，然后通过倒置光学显微镜观察各组大鼠心肌组织病理形态学变化。

1.5.4心肌组织中SOD、GSH-Px活性及T-AOC水平和MDA含量的测定参照1.5.2方法，取每组剩余10只大鼠心脏组织，剪碎、加入适量冷裂解液后进行研磨匀浆，经3 000 r/min离心10 min后取上清液，按照各试剂盒要求，通过紫外可见分光光度计平行测定各组大鼠心肌组织中SOD、CAT活性，T-AOC水平和MDA含量。

1.5.5心肌细胞凋亡的观察及凋亡指数的计算取1.5.3所制备的心肌组织石蜡切片，按照试剂盒操作步骤行TUNEL染色(细胞核黄褐色为阳性着色)，然后通过光学显微镜观察各组大鼠心肌细胞凋亡状况，计算心肌细胞凋亡指数：每张染色切片随机选取10个视野，分别计数每个视野中细胞总数和阳性着色细胞数，取平均值，凋亡指数(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5.6心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达的检测及半定量分析取1.5.3所制备的心肌组织石蜡切片，按照SP试剂盒操作方法步骤，通过免疫组织化学(IHC)方法测定各组大鼠心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达量；每张切片随机选取10个视野，通过BI-2000医学图像分析软件测定平均光密度(Optical Density，OD)值；根据OD值计算bcl-2/bax比值。

2结果

2.1各组大鼠血清中AST、CPK、LDH水平比较模型组大鼠血清AST、CPK、LDH水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，苦参素中、高剂量组大鼠血清AST、CPK、LDH水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清AST、CPK、LDH水平比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠心肌组织梗死面积假手术组心肌组织梗死面积为(0.0±0.0)%，模型组为(46.3±5.8)%，苦参素低剂量组为(40.5±6.7)%，苦参素中剂量组为(31.9±5.0)%，苦参素高剂量组为(23.6±4.1)%，地尔硫卓组为(34.2±4.8)%。模型组大鼠心肌组织梗死面积明显高于假手术组(P<0.05)；苦参素中、高剂量组大鼠心肌组织梗死面积明显低于模型组(P均<0.05)。

2.3各组大鼠心肌组织结构形态HE染色发现，假手术组大鼠心肌纤维平行排列，心肌细胞形态正常，未见异常；模型组大鼠心肌纤维紊乱、断裂，间质水肿变性，心肌细胞呈空泡变性、胞质着色不均、胞核固缩等；苦参素低、中、高剂量组大鼠心肌组织病理形态学变化与模型组比较有不同程度的好转，其中以苦参素高剂量组改善最为明显。见图1～6。

图1　假手术组心肌组织病理形态学表现(HE)

2.4各组大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性，T-AOC水平和MDA含量比较模型组大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性和T-AOC水平均明显低于假手术组(P均<0.05)，MDA含量明显高于假手术组(P<0.05)；苦参素中、高剂量组大鼠心肌组织中SOD活性与模型组比较显著升高且MDA含量显著降低(P均<0.05)，其中苦参素高剂量组GSH-Px活性和T-AOC水平均显著高于模型组(P均<0.05)。见表2。

图2　模型组心肌组织病病理形态学表现(HE)

图3　苦参素低剂量组心肌组织病理形态学表现(HE)

图4　苦参素中剂量组心肌组织病理形态学表现(HE)

图5　苦参素高剂量组心肌组织病理形态学表现(HE)

图6　地尔硫卓组心肌组织病理形态学表现(HE)

组别nSOD/(IU/mg)GSH-Px/(IU/mg)T-AOC/(IU/mg)MDA/(nmol/mg)假手术组1081.5±9.64.7±0.813.4±2.82.1±0.3模型组1049.2±7.0①2.5±0.7①7.6±2.1①3.2±0.4①苦参素低剂量组1056.4±8.12.8±1.28.3±2.62.8±0.7苦参素中剂量组1063.8±10.5②3.0±1.19.0±3.12.5±0.6②苦参素高剂量组1069.6±11.7②3.8±1.4②10.8±3.4②2.3±0.5②地尔硫卓组1061.5±9.8②3.1±1.49.2±3.32.1±0.4②

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.5各组大鼠心肌细胞凋亡及凋亡指数比较假手术组大鼠心肌细胞仅可见极少量凋亡细胞，而模型组大鼠心肌细胞凋亡数量明显增多；与模型组比较，苦参素各剂量组大鼠心肌细胞凋亡数量呈不同程度减少，其中以苦参素高剂量组最为显著，见图7～12。假手术组凋亡指数为(2.7±1.3)%，模型组凋亡指数为(59.4±10.6)%，苦参素低剂量组凋亡指数为(47.5±9.3)%，苦参素中剂量组凋亡指数为(41.0±7.2)%，苦参素高剂量组凋亡指数为(28.9±5.6)%，地尔硫卓组凋亡指数为(42.3±6.8)%。模型组大鼠心肌细胞凋亡指数明显高于假手术组(P<0.05)，苦参素中、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡指数明显低于模型组(P均<0.05)，且苦参素高剂量组明显低于苦参素低、中剂量组(P均<0.05)。

图7　假手术组心肌细胞凋亡表现(TUNEL)

图8　模型组心肌细胞凋亡表现(TUNEL)

2.6各组大鼠心肌组织中bcl-2蛋白表达IHC染色表现模型组大鼠心肌组织中bcl-2蛋白表达与假手术组比较明显上调；而苦参素中、高剂量组大鼠bcl-2蛋白表达与模型组比较进一步上调，其中以苦参素高剂量组效果最为显著。见图13～18。

2.7各组大鼠心肌组织中bax蛋白表达IHC染色表现模型组大鼠心肌组织中bax表达与假手术组比较明显上调，而苦参素中、高剂量组大鼠bcl-2表达与模型组比较明显下调，其中以苦参素高剂量组效果最为显著。见图19～24。

图9　苦参素低剂量组心肌细胞凋亡表现(TUNEL)

图10　苦参素中剂量组心肌细胞凋亡表现(TUNEL)

图11　苦参素高剂量组心肌细胞凋亡表现(TUNEL)

图12　地尔硫卓组心肌细胞凋亡表现(TUNEL)

图13　假手术组心肌组织bcl-2蛋白表达IHC染色表现

图14　模型组心肌组织bcl-2蛋白表达IHC染色表现

图16　苦参素中剂量组心肌组织bcl-2蛋白表达IHC染色表现

图17　苦参素高剂量组心肌组织bcl-2蛋白表达IHC染色表现

图18　地尔硫卓组心肌组织bcl-2蛋白表达IHC染色表现

图19　假手术组心肌组织bax蛋白表达IHC染色表现

图20　模型组心肌组织bax蛋白表达IHC染色表现

图21　苦参素低剂量组心肌组织bax蛋白表达IHC染色表现

2.8各组大鼠心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达OD值及bcl-2/bax比值比较模型组大鼠心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达OD值均明显高于假手术组(P均<0.05)，bcl-2/bax比值明显低于假手术组(P均<0.05)；苦参素中、高剂量组大鼠心肌组织中bcl-2 蛋白表达OD值和bcl-2/bax比值均明显高于模型组(P均<0.05)，bax蛋白表达OD值均明显低于模型组(P均<0.05)。见表3。

图22　苦参素中剂量组心肌组织bax蛋白表达IHC染色表现

图23　苦参素高剂量组心肌组织bax蛋白表达IHC染色表现

图24　地尔硫卓组心肌组织bax蛋白表达IHC染色表现

3讨论

冠心病及其所引发的急性心肌梗死是临床常见的心血管疾病，目前临床上主要采取溶栓、介入手术等冠状动脉再通术及时恢复血流供应，明显降低了心肌梗死患者的病死率，但“再灌注损伤”的存在严重影响着该类患者的预后。近年来，随着病理生理学研究的深入，发现再灌注后出现的氧化应激损伤以及继发的细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发生发展过程中的重要环节[7-8]，这也为今后研发抗心肌缺血再灌注损伤的新型药物提供了方向。

表3　各组大鼠心肌组织中bcl-2、bax蛋白表达OD值及bcl-2/bax比值比较

注：①与假手术组比较,P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量是临床上诊断心肌细胞损伤的常用指标。生理状态下，血清中心肌酶含量都非常低；当心肌细胞膜受氧自由基攻击受损后，AST、CPK、LDH将迅速释放入血而导致三者含量陡然增高，所以它们在血清中的水平能够敏感地反映心肌细胞受损程度[9-10]。SOD被称为体内防御氧自由基损伤的第一道屏障，它能够提供氢原子配体而催化还原氧自由基生成过氧化氢[10]，并且在GSH-Px的催化作用下能够进一步被还原生成对人体无害的水和氧[11]；心肌组织中T-AOC水平能够反映心肌抵抗氧自由基损伤能力，脂质过氧化终产物MDA含量能够间接反映心肌细胞氧化应激损伤程度。

细胞凋亡是多种基因参与的主动性细胞死亡过程，存在着非常复杂的调控机制；其中bcl-2为凋亡抑制基因，bax为促凋亡基因，它们均属于bcl-2基因家族，二者间相互作用、共同调控细胞凋亡[12]；进一步研究发现，细胞凋亡不仅与bcl-2和bax的表达密切相关，更依赖于bcl-2/bax比值[13]。

苦参素是一种具有多种药理学作用的喹诺西啶类生物碱，本实验发现，苦参素能够显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织梗死面积，改善心肌组织病变，降低血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量，提高SOD、GSH-Px活性及T-AOC水平，降低MDA含量；抑制心肌细胞凋亡，提高抑凋亡蛋白bcl-2表达，降低促凋亡蛋白bax表达，提高bcl-2/bax比值。提示苦参素对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激和细胞凋亡具有抑制作用；其作用机制与苦参素能够有效增强抗氧化酶活性，调节凋亡相关蛋白表达有关。

[参考文献]

[1]黄秀梅,李波. 氧化苦参碱对TNFA、IL-6和IL-8的影响[J]. 中成药,2003,25(11):903-906

[2]任衍菊,张玉萍,金敏,等. 氧化苦参碱体外抗乙型肝炎病毒作用[J]. 中国实验方剂学杂志,2012,18(14):175-179

[3]孔秀岩,苏志刚. 氧化苦参碱对细胞凋亡影响的研究现状[J]. 河北医药,2007,29(12):1371-1373

[4]贾昌盛,孙建军,李美德,等. 苦参素降低大鼠肾脏缺血-再灌注损伤[J]. 基础医学与临床,2012,32(8):943-947

[5]孟凡强,姜洪池,孙学英,等. 苦参素对大鼠肝缺血再灌注中肝细胞的保护作用及其机制探讨[J]. 中华医学杂志,2005,85(28):1991-1994

[6]徐叔云,卞如濂,陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京：人民卫生出版社,2002:45

[7]Han ShX,Yao HL,Li YY,et al. Protective effects of Cuscuta ch-inensis Lam. extract on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull,2011,27(4):533-536

[8]Lamendola P,Di Monaco A,Barone L,et al. Mechanisms of myocardial cell protection from ischemia reperfusion injury and potential clinical implications[J]. Ital Cordial (Rome),2009,10(1):28-36

[9]刘胤敏,吴红兵,周银,等. 复方丹参滴丸对心肌缺血大鼠心肌酶学与心肌组织学的影响[J]. 时珍国医国药,2011,22(12):2878-2880

[10] Lartigue A,Burlat B,Coutard B,et al. The megavirus chilensis Cu,Zn-superoxide dismutase:the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J]. J Virol,2014,2588(14):254-261

[11] Lei N,Wang M,Zhang L,et al. Effects of low molecular weight yeast β-Glucan on antioxidant and immunological activities in mice[J]. Int J Mol Sci,2015,16(9):21575-21590

[12] 张彦清,刘保江,田首元. 丙泊酚对大鼠离体缺血/再灌注心肌细胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表达的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志,2011,9(1):55-57

[13] Jayanthi S,Deng X,Bordelon M,et al. Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death Bcl-2 genes in the mouse neocortex[J]. FASEB J,2001,15(10):1745-1752

Effects of oxymatrine on oxidative stress and apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

CHEN Shujie

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of oxymatrine(OMT) on oxidative stress and myocardial apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods 120 rats were randomly divided into six groups: sham operation group, model control group, OMT(25, 50, 100 mg/kg) treated groups and diltiazem (1 mg/kg) treated group (positive control group); except the rats in sham operation group, the rat models were made by clamping the artery for 30 min, and the drugs were given after reperfusion immediately, once a day for 7 days. Seven days later, the areas of myocardial infarction were analyzed by TTC staining, the histopathological changes was observed by HE staining; the content of AST, CPK, LDH in serum were determined; the activity of SOD, GSH-Px, T-AOC and the content of MDA in myocardial tissue were determined. The apoptosis of cardiomyocytes was observed by TUNEL and the apoptosis index was calculated; the expression of bcl-2, bax were detected by IHC and were Semi-quantitative analyzed, and the ratio of bcl-2/bax was calculated. Results Compared with the model control group, the areas of myocardial infarction of OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly decreased(P all<0.05); the histopathological changes were significantly improved, especially in the OMT 100 mg/kg treated group; the content of AST, CPK, LDH in serum of OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly decreased(P all<0.05); the activity of SOD in myocardial tissue was significantly increased and the content of MDA significantly was decreased (P all<0.05), the activity of GSH-Px and the level of T-AOC in OMT 100 mg/kg treated group were significantly increased(P<0.05). The cardiomyocytes apoptosis of OMT treated groups were significantly improved, and the apoptosis index of OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly decreased(P all<0.05); the expression of bcl-2 was significantly up-regulated, the expression of bax was significantly down-regulated, and the ratio of bcl-2/bax in OMT 50, 100 mg/kg treated groups were significantly increased(P all<0.05). Conclusion OMT had inhibition effects on oxidative stress and myocardial apoptosis in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury, which perhaps related to its effects of enhancing the activity of antioxidant enzymes, up-regulating the expression of bcl-2 and down-regulating the expression of bax, enhancing the ratio of bcl-2/bax.

Key words:oxymatrine; myocardial ischemia-reperfusion; oxidative stress; apoptosis

[收稿日期]2015-06-12

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)05-0476-07

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.05.007

[作者简介]陈树杰，男，硕士，副主任医师，从事心脏疾病研究工作。