三峡库区栽培重楼属药用植物中薯蓣皂苷元含量测定

张静 丁博 祁俊生 陈秀红 周浓

摘要：目的 建立高效液相色谱法测定重楼中薯蓣皂苷元含量，考察不同产地和不同品种重楼属药用植物中薯蓣皂苷元的含量。方法 采用岛津Inertsil ODS-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈-水（92∶8）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长203 nm，柱温30 ℃。结果 不同产地、不同品种的重楼属药材中均含有薯蓣皂苷元，渝北区的长药隔重楼含量最高（6.813 7 mg/g），城口县的狭叶重楼含量次之（5.758 4 mg/g），最低的为石柱县的滇重楼（1.952 2 mg/g），表明不同栽培品种重楼药材化学品质差异较大，可能与产地、品种及栽培技术等因素有关。结论 非药典品种长药隔重楼、狭叶重楼含量超过中国药典收载品种，具有较大的药用价值。

关键词：重楼；薯蓣皂苷元；高效液相色谱法；质量评价

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.021

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0080-04

Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the content of diosgenin in Paridis Rhizoma； To examine contents of diosgenin in different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and from different habitats. Methods Shimadzu Inertsil ODS-C18 guard column （150 mm×4.6 mm， 5?m） was used in HPLC system； elution conditions were the mobile phase using 92% acetonitrile and 8% water （isocraticelution） at a flow rate of 1.0 mL/min with 203 nm detection wavelength. The temperature of the column oven was maintained at 30 ℃. Results Different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and Paridis Rhizoma medicinal plants from different habitats contained diosgenin. The Paris polyphylla var. pseudothibetica in Yubei district had the highest content （6.813 7 mg/g）； Paris polyphylla var. stenophylla in Chengkou County had the middle content （5.758 4 mg/g）； Paris yunnanensis Franch in Shizhu county showed the lowest content （1.952 2 mg/g）. The results showed that the obvious difference of chemical quality between various cultivated varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants， which might be related with origin， variety and the cultivation technology， and so on. Conclusion The diosgenin contents of Paris polyphylla var. pseudothibetica and Paris polyphylla var. stenophylla were higher than that of varieties recorded in Chinese Pharmacopeia. Paris polyphylla var. pseudothibetica and Paris polyphylla var. stenophylla had important medical value.

Key words： Paridis Rhizoma； diosgenin； HPLC； quality evaluation

重楼主要活性成分为薯蓣皂苷和偏诺皂苷等类型，薯蓣皂苷通过水解可以得到薯蓣皂苷元[1-2]。薯蓣皂苷元是合成甾体激素类药物的重要原料，具有抗肿瘤、抗炎、心血管保护、免疫调节、抗氧化等多种生物活性，为重楼药材生物活性的物质基础[3]。三峡地区为重楼属药用植物的地理分布中心之一，药材品种较为丰富[4-5]，但存在种质来源复杂、分类不明等严重问题，导致其开发利用率较低。目前，已有对滇重楼[6]、七叶一枝花[7]、北重楼[8]等重楼药材中薯蓣皂苷元含量测定的报道。本试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定重楼药材中薯蓣皂苷元含量，并对比三峡库区不同产地、不同品种重楼药材质量，以期为三峡库区重楼药材资源的合理开发与利用提供参考。

1 仪器与试药

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司），RV 10 basic V型旋转蒸发仪（德国IKA集团），CP225D型分析天平（德国Sartorius公司）。

重楼新鲜根茎采自重庆市开县满月乡双坪村1组等地，每份样品均取10株成熟植株根茎以保证样品代表性，并由中国科学院昆明植物研究所李恒研究员鉴定（见表1）。薯蓣皂苷元对照品（批号111539- 200001，中国食品药品检定研究院，供含量测定用）。色谱纯乙腈为德国默克公司，其他试剂均为国产分析纯，水为娃哈哈牌纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

岛津Inertsil ODS-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-水（92∶8），流速为1.0 mL/min，检测波长为203 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 ?L，采集时间10 min，理论板数以薯蓣皂苷元峰面积计不得低于4000。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

取薯蓣皂苷元对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.539 0 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

参照周氏等[6]方法略作修改。精密称取本品粉末（过三号筛）约0.20 g，置250 mL具塞三角瓶中，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声提取（300 W，40 kHz）2 h，弃石油醚，残渣加入甲醇25 mL，超声提取（300 W，40 kHz）40 min，放冷，过滤，重复操作1次，合并滤液，减压回收甲醇至干，加2 mol/L盐酸10 mL，置沸水浴中水解2.5 h，放冷，置分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）萃取3次，每次30 mL，合并石油醚萃取液，水洗至中性，减压回收石油醚至干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品贮备溶液，采用逐级稀释法分别制得薯蓣皂苷元的0.027 0、0.053 9、0.134 8、0.269 5、0.404 3、0.539 0 mg/mL对照品标准液。分别精密吸取对照品标准液20 μL，注入液相色谱仪，得进样量（μg）与峰面积的线性方程。结果表明，薯蓣皂苷元在0.54～10.78 μg线性范围内其进样量与峰面积具有良好的线性关系，回归方程为Y=631 205X+52 970，r=0.999 8（n=6）。

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液（S3），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得薯蓣皂苷元峰面积的RSD=0.35 %，表明仪器进样精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（S3），室温密闭放置，按“2.1”项下色谱条件在0～24 h每隔4 h测定1次，结果薯蓣皂苷元峰面积RSD=1.89%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一重楼样品6份（S3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果薯蓣皂苷元的平均含量为2.539 5mg/g，RSD=1.61%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的重楼药材粉末约0.10 g（S3），共6份，分别精密加入薯蓣皂苷元对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果表明，薯蓣皂苷元平均回收率为96.81%，RSD=1.48%，符合分析要求（见表2）。

2.9 样品测定

分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，进样前过0.22 ?m微孔滤膜，进样20 ?L，进行HPLC分析，测定峰面积，以外标两点法计算各重楼中薯蓣皂苷元的含量，结果见表3。

3 讨论

对不同流动相体系、检测波长和供试品溶液的制备方法[6-8]进行了综合考察，结果表明，以乙腈-水（92∶8）的流动相体系等度洗脱所得色谱峰分离效果最佳；检测波长在203 nm处薯蓣皂苷元有最大吸收；甲醇为提取溶剂，超声提取40 min，超声提取2次，酸水解、有机溶剂萃取即可将重楼中的薯蓣皂苷元基本提取完全。

本研究结果表明，三峡库区不同产地的重楼药材普遍含有薯蓣皂苷元，但同一品种的不同产地重楼药材中薯蓣皂苷元含量存在较大差异，其中以重庆市城口县与重庆市石柱县产狭叶重楼中薯蓣皂苷元含量相差近2倍，重庆石柱县与重庆市万州区产滇重楼中薯蓣皂苷元含量也相差近2倍，但3个不同产地的七叶一枝花含量相差甚微，与付氏等[11]报道类似。造成三峡库区不同产地重楼薯蓣皂苷元含量差异的原因，可能与栽培技术、产地环境等有关[9-11]，表明需加大对重楼的人工栽培技术和产地适宜性研究，以确保重楼药材资源可持续利用和重楼医药产业可持续发展。

除2个中国药典法定品种（七叶一枝花和滇重楼）外，笔者还采集到其他5个种/变种，试验结果表明，重楼属不同种植物的薯蓣皂苷元含量存在较大差异（1.952 2～6.813 7 mg/g），渝北区的长药隔重楼含量最高，城口县的狭叶重楼含量次之，最低的为石柱县的滇重楼。不同品种间薯蓣皂苷元含量差异较大，非药典品种能否代替重楼入药有待进一步深入研究。

前期研究表明，重楼属植物大部分品种均在入药，且部分品种与中国药典收载品种（滇重楼和七叶一枝花）具有一定的化学成分等同性[4，11-12]。本试验结果进一步表明，不同品种重楼药材中薯蓣皂苷元含量差别很大，而民间有代用的习惯，因此制定其含量标准是很有科学意义的。

致谢：中国科学院昆明植物研究所李恒研究员在植物标本鉴定中给予的帮助。

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（收稿日期：2015-07-02）

（修回日期：2015-07-21；编辑：陈静）