一株黑曲霉产纤维素酶培养基优化
2016-05-30任海霞杨鹏郭惠东任鹏飞李瑾宫志远
任海霞 杨鹏 郭惠东 任鹏飞 李瑾 宫志远
摘要：采用单因素试验和正交试验对黑曲霉FSDZH-l摇瓶发酵生产纤维素酶的营养条件进行优化。结果表明：其最佳培养基配方（g/L）为：玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH4）2SO42.0，Na2HPO40.5，MgSO40.2，FeS04·7H2O0.1，CaCO30.5。在最佳培养基条件下，发酵液酶活力可达315.6U/mL。
关键词：黑曲霉；纤维素酶；培养基；优化
中图分类号：S182
文献标识号：A
文章编号：1001-4942（2016）01-0067-04
纤维素是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界中数量最大的可再生资源 。在工业、农业和生活废料中，纤维素含量占有相当大的比重。我国是农业大国，每年产生农作物秸秆7亿吨左右，目前这些秸秆通常被大量焚烧，不仅污染环境，而且浪费资源 。利用微生物降解纤维素因具有效率高、无污染、作用条件温和、节约等优点而成为当前热点之一，具有很大的应用潜力 。利用微生物处理纤维素其核心技术是优良的纤维素酶生产菌株及其产酶技术 。而产酶过程是非常复杂的生物化学反应过程，因此，研究菌体的代谢规律以及影响菌体产纤维素酶的各种营养因素和环境因素非常重要。本研究主要采用单因素试验和正交试验对影响产酶的各营养成分进行分析，以获得黑曲霉产纤维素酶的最佳培养基。
1 材料与方法
1.1 菌种
黑曲霉（Aspergillus niger）FSDZH-1，本实验室保藏。
1.2 主要原料和试剂
小麦粉、玉米粉、玉米浆、豆粕粉、羧甲基纤维素钠（美国Sigma公司），其它化学试剂。
1.3培养基及发酵条件
1.3.1 斜面培养基PDA培养基
1.3.2 初始产酶培养基 淀粉3g，Na2HPO20.1g， NaNO30.5g，CaCO30.05g，MgSO40.015g，Fe-SO4·7H2O0.005g，水100mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
1.3.3 发酵条件将斜面菌种制成孢子悬液，接种于80mL基本培养基（500mL三角瓶）中，接种量为7.5×104孢子/mL发酵液，30℃、200r/min摇瓶培养32h。
1.4 试验方法
1.4.1 产酶培养基优化①单因素试验：在初始培养基基础上，依次以6种常见碳源（见表1）分别代替基础培养基中的碳源、以常见的几种无机氮源和有机氮源（见表2）代替基础培养基中的氮源（添加量以N元素浓度相等为依据）以及不同浓度的MgS04、FeS04.7H20、CaCO。等无机盐，进行单因素试验，通过纤维素酶活力筛选最适碳源、氮源、无机盐及相应的浓度。
②正交试验：在单因素试验确定的最适Mg-SO4、FeSO4·7H2O、CaCO3浓度基础上选择不同浓度的玉米粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、NaNO3、Na2HPO4进行五因素四水平的正交试验，试验数据使用Latin正交软件进行处理，通过纤维素酶活力确定该菌株产纤维素酶最佳培养基。
1.4.2 纤维素酶活力测定 取1.0%羧甲基纤维素钠溶液1.8mL，50℃预热5min，准确加入适当稀释酶液200μL，在50℃水浴中准确反应30min，立即分别加入DNS试剂3mL，空白管中加入灭活酶液200μL，立即沸水浴10min，终止反应。冷却后定容至25mL，于540nm波长下测定样品管中OD值，通过DNS法测定还原糖含量，并对照标准曲线测算酶活力。
酶活力单位定义：在50℃反应条件下，每分钟从浓度为1%的羧甲基纤维素钠溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（U）。
2 结果与分析
2.1 不同碳源物质对产酶的影响
试验结果（表1）表明玉米粉是最佳碳源，发酵液酶活达到了108.90U/mL，小麦粉次之，淀粉作为碳源，发酵液的相对酶活力也达80%以上。而葡萄糖等低聚糖作为碳源产酶较低，可能是因为它们不需要胞外酶的水解就能被细胞直接利用，对纤维素酶的合成产生了阻遏作用。
2.2 不同氮源物质对产酶的影响
试验结果（表2）表明，有机氮源的酶活普遍高于无机氮源，与孙旭东等结论相近。蛋白胨、玉米浆作为有机氮源时，发酵液都有较高酶活，而且无机和有机混合作为氮源，发酵液酶活力普遍高于单独使用有机或无机氮源。（NH4）2SO4和蛋白胨混合作为氮源时，发酵液酶活最高，达到了214.54U/mL，可能是因为（NH4）2SO4中的NH4+是比较容易被微生物利用的“速效氮源”，而蛋白胨中氨基酸含量比较高，也是易被菌体吸收利用的长效氮源。
2.3 MgSO4浓度对产酶的影响
对细胞来说，Mg2+是金属离子中较为重要的一种。本研究在培养基中添加不同量的MgSO4，检测发酵液的酶活。图1结果表明，MgSO4最适浓度为0.2g/L，超过0.2g/L会抑制酶的活性。2.4FeSO4·7H2O浓度对产酶的影响
铁是维持微生物代谢活动必需的微量元素之一。本研究在产酶培养基中添加不同浓度的FeSO2·7H2O，检测发酵液酶活。图2结果表明，FeSO4·7H2O的最适浓度为0.10g/L，Fe2+过量或不足都会影响发酵液酶活。
2.5 CaCO3浓度对产酶的影响
钙一般不参与微生物的细胞结构物质，但它是某些酶的激活剂，还可调节发酵液的pH值，而且钙离子能调节细胞透性，对纤维素酶也有一定的激活作用。图3结果可以看出，CaCO3的最适浓度0.5g/L。
2.6 正交试验确定最佳培养基配方
前面分析了培养基中各单因素对产酶的影响，但在产酶过程中往往各个因素之间还有较大的影响，因此需要对各因素进行综合考察确定最佳产酶条件，尤其是选择合适的碳、氮源浓度及碳氮比对菌株的生长和产酶有直接关系。通过正交试验既可以确定合适的碳氮比和碳、氮源浓度，也可以从多个因素中分析主次，分析各因素对产酶的影响规律，还可以考察各个因素的相互作用对产酶的影响，从而得出最佳产酶条件。
由表3可知，玉米粉浓度是影响最显著的因素，玉米粉浓度在40.0g/L以下时，发酵液酶活力随小麦粉浓度的增大而增大，玉米粉浓度大于40.0g/L时，发酵液酶活力不再增长，主要是因为初始糖浓度太高影响了溶氧，而且也抑制了菌体生长，因而影响了产酶。五个因素对发酵产酶的显著性依次为A>B>C>E>D，最佳条件分别为A3B2C2D1E2，即最适浓度（g/L）为玉米粉40，蛋白胨3.0，（NH4）2SO42.0，NaNO30，Na2HPO40.5。按培养基配方（g/L）为玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH4）2SO42.0，NaNO30，Na2HPO40.5， MgSO40.2，FeSO4·7H2O0.1，CaCO30.5进行验证试验，发酵液纤维素酶活力315.60U/mL，每毫升发酵液比处理10高出9.24U。
3 结论与讨论
通过对黑曲霉FSDZH-1产纤维素酶培养基的研究，得出最佳培养基为（g/L）：玉米粉40.0，蛋白胨3.0，（NH4）2SO42.0，Na2HPO40.5，MgSO40.2，FeSO4·7H2O0.1，CaCO30.5。每毫升发酵液酶活力达315.6U，而且黑曲霉的酶系比较丰富，有进一步深入研究进而实现工业化生产的潜力。但是摇瓶发酵工艺和大罐发酵工艺还不尽相同，如果扩大生产，还需要在摇瓶发酵的基础上进一步优化发酵罐工艺，以获得最佳生产参数。
