新一代生物燃料正丁醇的发展

杨俊杰 闻志强 杨晟 蒋宇

生物制造是以现代生物技术为基础，大规模生产人类所需的化学品、药品、能源和材料的一种新型工业模式，可以从源头上解决资源短缺和环境污染问题。其中，正丁醇作为大宗化工原料或下一代生物燃料，是重要的工业生物制造的产品之一。

现代工业体系的发展是建立在对石油和煤炭等化石资源的开采和利用基础之上的。化石资源需要漫长的地质时期才能形成，不可再生，而且大规模使用化石资源还会增加温室气体排放。现代生物技术的崛起，为人类的工业生产找到一条可持续发展的、绿色环保的道路。

正丁醇既是重要的大宗化工原料，又是继乙醇后的一种极具发展前景的新一代液体燃料。利用生物制造技术生产的正丁醇是生物燃料和化工原料领域的代表性产品之一。通过产溶剂梭菌（Clostridia）的厌氧发酵，可将合适的碳水化合物转化为丙酮（acetone）、正丁醇（n-butanol）和乙醇（ethanol）等溶剂，此类溶剂生产技术因而也被简称为ABE发酵。

生物正丁醇制造的历史和现状

生物法制备正丁醇可追溯到第一次世界大战期间，以产溶剂梭菌厌氧发酵产生的正丁醇为起始原料合成丁二烯橡胶，是当时生产合成橡胶的最理想路线。因此，在合成橡胶大规模生产的同时，以玉米粉等碳水化合物为底物的溶剂发酵得到快速发展，一度发展为仅次于酒精发酵的世界第二大发酵工业。但是，从1950年代开始，由于受到石油工业的冲击，ABE发酵逐渐衰落，在欧洲、北美和日本等地逐步停止了生产。而中国，由于当时特殊的经济和政治环境，成为少数几个仍进行ABE发酵生产的国家之一。1955年，中国第一家ABE发酵工厂——上海溶剂厂开始使用玉米发酵生产ABE。随后的二三十年间，在北京、江苏、天津、云南、山西、浙江、河北、山东、吉林等省市，又陆续建立了约30家规模在年产3000-10000吨的ABE发酵工厂，使得国内ABE年生产能力达到17万吨。然而，石油合成化工的蓬勃兴起使得发酵法生产ABE在生产成本上越来越没有竞争优势，因此，国内ABE发酵企业自1990年代开始逐步关闭。

进入21世纪，随着国际石油价格的剧烈波动，以及基于石油资源不可再生性的共识，发酵法生产ABE技术重新引起广泛关注。近几年，多个厂家正丁醇生产线复产或者建成投产。年设计产量可达100万吨规模。但2008年底的金融危机使得正丁醇价格从每吨1.3万元下跌到5000元，迫使很多工厂停工或关闭。

目前，随着油价逐步走低，石化法生产正丁醇的成本相应下降。根据笔者掌握的中国正丁醇生产情况估算，目前石化法生产正丁醇的成本约为1.57美元/千克，而传统ABE发酵正丁醇成本约为1.83美元/千克，因此石化法在成本上占优势。但是如果从用于正丁醇发酵的原料理论碳利用率（即理论上原料中碳原子以最佳的生物代谢过程转化为正丁醇的比率）核算，生物法的理论原料成本远低于石化法的理论原料成本。因此，随着技术发展和提高，通过降低过程成本，生物法的实际碳利用率会不断提高，生物法有替代石化法的可能性。此外，生物法有可再生的优势，不会向生物圈的碳循环引入更多的碳。中国是少数几个至今仍具备正丁醇发酵生产能力的国家之一。

正丁醇发酵的工艺

梭菌是产溶剂工业菌种的唯一来源，传统ABE发酵中使用的工业菌种名目繁多，有关产溶剂梭菌的分类学和系统发育相关性研究比较混乱。近年来，通过系统学、基因组DNA/DNA杂交和DNA指纹图谱，以及发酵性能等方面的比较研究和分析，一般认为工业用产溶剂梭菌归为4个种（species），所有原来的淀粉发酵型菌株隶属于一个种，即丙酮正丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）。该菌呈现较强的淀粉酶活力，适用于发酵玉米和谷类等淀粉质原料，同时具有独特的系统发育特性。其他3个紧密相关的种，包括拜氏梭菌（C.beijerinckii）、糖丁酸梭菌（C.saccharobutylicum）和糖乙酸多正丁醇梭菌（C.saccharoperbutylacetonicum）与前者亲缘关系较远。

已鉴定的糖一发酵菌株大多数隶属于拜氏梭菌。除南方少数企业外，针对我国以谷、薯类为主的农业生产状况，溶剂发酵菌种多为丙酮正丁醇梭菌，且由国内的研究所或工厂自行选育驯养而来，如中国科学院微生物研究所的AS l.70.上海溶剂厂的具抗噬菌体能力的新抗-2号。这些菌种所产溶剂中，3种组分（正丁醇、丙酮、乙醇）的比例均为6：3：1。“七五”期间，中国科学院上海植物生理生态研究所的杨蕴刘通过土样分离和诱变筛选获得到了高正丁醇比例的菌株EA 2018，其溶剂中3种组分的比例达到7：2：1，淀粉转化率比传统菌种高5%。此外，其他溶剂厂也结合自身特点，选育出适用于特定原料如糖蜜、水解液的菌种。

传统发酵法生产正丁醇的工艺主要包括溶剂的连续发酵、产物和副产物的蒸馏法分离提取、生产过程中的环境保护措施等。

20世纪四五十年代，工业生产中生物正丁醇发酵使用的是大容积的批式发酵罐（20万-80万升）。主要发酵基质是玉米粉或糖蜜，每批发酵进行40-50小时。这种发酵方式相对简单，但生产效率低，操作麻烦，劳动强度大，清洗消毒的物质和能量消耗也大。20世纪五六十年代开始逐步实施连续发酵工艺，目前国内大规模正丁醇生产采用连续发酵工艺。连续发酵产率通常是批式发酵的2-3倍。减少了清洗消毒操作，还减少了物质和能量消耗及废水排放。

产物提取是正丁醇发酵中能量消耗较大的环节。发酵液中正丁醇含量一般仅2%左右。工业生产一般采用连续蒸馏的方法。通入蒸汽，利用正丁醇和丙酮、乙醇、水等组分凝沸点的差异，通过一系列蒸馏塔装置，将各组分分馏出来。而后通过精馏使产品进一步纯化。随着社会环保意识的加强，减少三废排放已成为正丁醇工艺研究的一个重要方向。

生物正丁醇制造面临的挑战

从传统生物正丁醇生产成本构成看，原料和蒸汽成本分别占75%和16%。生物正丁醇生产中与这两项成本相关的可改进的方面是：用作发酵的碳源成本偏高和政策限制；发酵过程中的正丁醇选择性较低；发酵液中的正丁醇效价（即单位纯品质量所含的有效成分）低。

获取廉价发酵原料是所有生物基产品的共性问题

在正丁醇生产中，由于原料成本占总成本的3/4左右，因此原料问题对于降低生产成本尤为重要。近年来由于国内以玉米等粮食作物为原料的生物炼制行业发展迅速，一定程度上促成全国粮食价格较快上升，致使生物正丁醇生产成本大幅度增加。同时，国家出于维护粮价稳定和粮食安全战略的考虑，开始限制大规模使用玉米等粮食作物来发展生物能源。因此，如何通过提高原料转化率和利用廉价非粮类原料生产正丁醇、降低生产成本，成为该产业必须直面的瓶颈问题。

选择同型正丁醇发酵提高正丁醇发酵经济性

传统ABE发酵生成的是三联产物：丙酮、正丁醇和乙醇，还有少量有机酸。这使正丁醇占总溶剂（丙酮、正丁醇、乙醇）的质量比为60%-70%，增加了后续产品分离设备的投入及能耗；且正丁醇对原料（以葡萄糖计算）的质量转化率为25%-29%，仅为理论值的61%-71%。如果采用同型正丁醇发酵，可提高原料利用率、降低原料成本，且不受三种产品市场供求差异的影响。

提高发酵产物正丁醇的浓度

传统ABE发酵工艺中，正丁醇浓度不到2%，导致蒸馏成本约占生物正丁醇生产总成本的20%。如果将正丁醇发酵产物的浓度由12克/升提高到19克/升，产物分离的后续蒸馏成本可降低一半。然而，传统丙酮正丁醇梭菌发酵生产中的正丁醇终浓度维持在13-14克/升，难于超过这一阈值的原因在于所生成的产物是溶剂。其中特别是因为正丁醇对产溶剂梭菌细胞的毒害作用。提高产溶剂梭菌的耐受性或在高耐受正丁醇的宿主中重构产正丁醇途径，有望实现高浓度正丁醇发酵。

针对挑战的探索

原料的开发

（1）非粮作物。非粮作物包括薯类、菊芋、甜高粱等。薯类是淀粉含量很高的农作物，包括木薯、红薯、马铃薯等，在我国和世界各地均有大量种植。薯类原料的价格较玉米、小麦等粮食类原料低廉，因此已被大量用于生物乙醇的生产。一些生物正丁醇生产企业也在玉米原料中混入薯类原料进行发酵，以减少玉米用量。菊芋是一种多年生草本植物（俗称洋姜、鬼子姜），生物量极大，每公顷可产菊芋块茎30-75吨。鲜菊芋块茎中富含多聚果糖，是一种极具开发潜力的半野生资源，是微生物发酵生产生物基化学品的良好糖源。国外以菊芋为原料发酵制备正丁醇的研究较多。甜高粱是普通粒用高粱的一个变种，具有抗旱、耐涝、耐盐碱、适应性强、生物量高、糖分高等特点，是名副其实的高效能植物。用不适宜粮食作物生产的边际性土地种植甜高梁，将甜高梁秆榨汁，利用其中糖分发酵生产燃料，是另外一条思路。上述非粮作物能一定程度上缓解生物正丁醇的高成本，但其成本还是太高。

（2）木质纤维素。木质纤维素被普遍认为是一种最具应用潜力的发酵原料。近年来，国外围绕木质纤维素发酵制备ABE溶剂的研究多有报道。目前的主流工艺是：原料预处理和水解为单糖，糖液发酵生成正丁醇，产物蒸馏回收等。尽管工艺路线具可行性，但仍有诸多技术瓶颈需要克服。仅就菌种而言，纤维水解液中五碳糖和六碳糖的同等利用是迫切需要解决的难点之一。另外，纤维素水解时需添加大量纤维素酶，这也将大幅增加生产成本。

利用纤维素直接生产正丁醇是更理想的工艺，但是产溶剂梭菌不具备纤维素降解能力。将纤维素降解菌，如嗜纤维梭菌（C.cellulovorans），和产溶剂梭菌，如拜氏梭菌（C.beijerinckii），混菌培养，使两种菌各司其职、互利共生，可实现纤维素正丁醇的“一锅法”生产，免去纤维素酶生产和添加过程。不过，共生系统的调控过程比较复杂，需兼顾体系内各微生物种群的生长及代谢特点，维持系统稳定和调控以及优化系统均较为困难。一旦混菌系统中种群比例失衡，会使得营养组分摄取竞争加剧，或者外界条件偏利于某阶段的非“优先”种群，互利或偏利关系将会大大削弱甚至导致共生系统崩溃。为实现混菌体系的高效性、稳定性和可控性，需针对混菌体系的设计与构建原理，以及高效混菌体系的物质流、能量流、信息流的适配与调控机制开展研究，利用用合成生物学手段实现纤维素正丁醇的高产。

（3）合成气。合成气主要是由CO、H₂、C0₂组成的混合气体，来源广泛，包括煤、油页岩、焦油沙、重残渣、劣质天然气以及生物质。以合成气为原料合成氨、含氧化合物和烃类等化工原料的生产技术已投入商业运行。近年来，以生物技术主导的合成气综合利用技术引起广泛关注，尤其是通过厌氧发酵方法将合成气转化成各种有用的燃料和化学品已成为新的研究热点。

微生物利用钢厂尾气厌氧发酵生产乙醇的技术接近商业化。永达尔梭菌（C.ljungdahlii）是目前合成气发酵产乙醇最具潜力的菌株。乙醇发酵的产物浓度上升到23克/升。

而目前已知的可利用合成气发酵生产正丁醇的微生物菌株仅有C.carboxidivorans P7（DSM15243）和Butyribacterium methylotrophicum（DSM3468），正丁醇产量分别为1.776克/升和2.7克/升。为实现合成气生产正丁醇的产业化，后续研究中可通过以下方式实现产量提升：在C.ljungdahlii等乙醇生产菌株中引入乙醇到正丁醇的代谢途径；对天然的可利用合成气发酵生产正丁醇的微生物进行代谢工程改造，提高正丁醇的生产强度；在传统的利用糖源的正丁醇生产菌株中导入合成气代谢途径。

提高正丁醇比例

提高正丁醇比例可通过对微生物正丁醇途径的重构和优化来实现。经典的正丁醇代谢途径来源于产溶剂梭菌。产溶剂梭菌除生成60%-70%的正丁醇外，还有20%-30%的丙酮和10%的乙醇两种低值副产物。通过对正丁醇途径的重构和优化有可能降低丙酮和乙醇的合成量，在保持菌株原有较高转化效率的基础上，进一步提高正丁醇在总溶剂中所占的比例。

近十年来，采用现代生物技术手段，利用基因工程和代谢工程技术改造正丁醇发酵菌种（包括基因敲除、基因表达和应用反义RNA进行基因调控等）以及通过解除代谢过程中可能存在的产物和中间产物抑制，强化正丁醇生产中的关键酶，切断或者弱化丙酮、乙醇等副产物生成的代谢途径，提高了正丁醇在溶剂中的比例。

提高正丁醇浓度

正丁醇对菌体细胞具有较大毒性，通过菌株遗传改造增强其正丁醇耐受性，为提高正丁醇生物合成的选择性和产物浓度创造了有利条件。为降低发酵产物正丁醇对生产菌种的抑制作用，尚可通过发酵和改进下游工艺，来减轻发酵液中的正丁醇毒性，进而提高发酵终点的正丁醇浓度。另一思路是，在高耐正丁醇菌株中构建异源正丁醇途径。

传统正丁醇发酵中，产物浓度提高主要受制于菌株正丁醇耐受性差。主要的产溶剂梭菌C.acetobutylicum的正丁醇耐受极限低于2%（体积比）。从菌体细胞对正丁醇耐受性的研究结果来看，该表型是由多基因决定的，并且拥有十分复杂的调控网络，这使得对目前菌株的正丁醇耐受性改造存在一定困难。研究发现，某些菌株如Lactob ac illLLs6rev is、Lactobacillus delbrueckii具有明显高于目前产溶剂梭菌的正丁醇耐受性，表明高正丁醇耐受性的菌株在自然界中是存在的。研究者通过驯化和筛选等策略，获得2株正丁醇耐受菌株，经鉴定均属于乳酸杆菌属（Lactobacillus）。在此基础上，通过对一个乳酸菌库的正丁醇耐受性检测，发现其中大部分菌株具有明显高于产溶剂梭菌的正丁醇耐受性，这暗示乳酸杆菌属作为一个整体，可能具有较高正丁醇耐受性。同时，获得数株正丁醇耐受极限高于3%（体积比）的菌株，有潜力成为构建正丁醇途径的宿主菌。

展望

正丁醇目前的石化法较之生物法在成本上占优。生物法原料理论成本远低于石化法原料理论成本。随着各项技术不断提高，生物法有替代石化法的可能性。此外，生物法还具备碳中性的优势。中国是少数几个至今仍具备正丁醇发酵生产能力的国家之一。目前纤维素正丁醇是目前唯一正在商业化进程中的路线，其经济效益有待市场考证。进一步提高其经济性则有待其他各项技术的共同进步，以及国家政策的鼓励。以钢厂尾气制备正丁醇是有望获得最大经济性的技术路线，但要获得可商业化的菌种尚有诸多挑战。