中学探究实验

姜珊多娇 杨海

摘 要 植物组织培养是一个严格的无菌操作过程。外植体的选择、分离、表面消毒，培养基及其操作工具的灭菌处理，接种室和超净工作台的灭菌处理、操作人员的消毒，无论哪个环节出现了差错，都会导致组培材料的大量污染。消毒灭菌的成功也是组培实验的根本保证。基于此，经过大量实验，总结出降低杂菌污染率的消毒灭菌方法，并使这套方案具有可操作性，能适应中学实验室条件下的实验要求，为其他组培实验者提供借鉴。

关键词 消毒；灭菌；培养基；植物组织培养

中图分类号：Q813.1+2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.29.053

组织培养的培养基中含有丰富的营养物质，不仅为植物外植体的生长提供营养，也可能成为微生物滋生的温床。当一块植物组织被接种到培养基上后，就会变得很脆弱，微生物的大量繁殖会严重影响植物的生长，甚至引发死亡，所以在接种前一定要做好灭菌工作。但这一工作对实验者的要求较高，笔者也是在实践中反复探索才得出了一套较好的方案，并将它系统地整理出来，以供参考。

1 问题引导

在组织培养的实验課中，首先进行的是胡萝卜与非洲紫罗兰的组织培养，因为是初次接触这方面的实验，缺乏经验，笔者并未重视消毒灭菌这一环节，并且无菌操作的动作也不是很规范和熟练，在操作细节中漏洞很多。当培养7 d后打开培养箱，发现大部分的培养基被杂菌污染。由于实验的失败，笔者开始重视消毒灭菌这一环节。利用这次发现的问题，分析总结杂菌污染的原因，并把该问题作为一个课题研究，在后续的实验中，设计各种方案进行比较，观察哪种方法能减少外植体的污染。笔者按照教材中的无菌操作要求，分析实验过程的每一个细节，甚至包括操作动作中是否可能带入杂菌。将可能导致实验失败的各细节分析清楚后，同时查找资料，又提出一些解决办法，重新设计了实验方案，重新实验。

2 探索中得出方案

接下来要进行的是芦荟组织培养。这次实验前，针对芦荟组织的结构特征进行了分析，并讨论出以下消毒灭菌的方案。

2.1 关于植物材料

第一步：将植物置于流动的无菌水下冲洗。由于时间关系及条件限制，这一步笔者并没有在实践中应用，但可作为初步清洗方案。注意：节约用水，做好废水的再次利用工作。

第二步：去除植物材料中的枯烂部分，选取健康饱满的部位用牙刷进行刷洗。注意：第一，刷洗过程中要注意力道，不要太过用力导致植物材料遭到破坏，以致接种后无法存活，最好使用软毛牙刷，刷洗时要反复多次，彻底清除污物；第二，刷洗过程中要勤换水；第三，有些植物有刺，可先剪掉刺再刷洗。

第三步：将植物按表1中的顺序进行消毒。注意：第一，酒精会损伤植物，因此在酒精中的浸泡时间不能超过10 s；第二，B和C可互换顺序；第三，以上3个消毒步骤之间，需要将植物材料放在无菌水中清洗，以洗去表面的残留药品。

第四步：以上3步完成后，立即将植物浸泡于无菌水中，并放入已灭菌过的超净工作台中。

2.2 培养基的灭菌处理

锥形瓶：用刷子将锥形瓶彻底刷洗干净；培养基：将已配制好的培养基倒入锥形瓶中并封好口后，放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，按照操作程序操作，在达到压力要求后灭菌20 min即可实现彻底灭菌的效果。灭菌完成后，要立即把培养基从高压蒸汽灭菌锅中取出，并放入已灭菌后的超净工作台中。取出时要佩戴棉手套，以免烫伤。

2.3 操作台和操作间的消毒与灭菌

超净工作台：在将材料、培养基、工具等实验操作中所用到的物品放入超净工作台前，用酒精棉对操作台进行消毒处理，并且与接种室一起用紫外线灯灭菌。

接种室：在实验前20 min，打开超净工作台的紫外线灯与无菌风幕，并且实验所用到的物品此时也都放进超净工作台中，在紫光灯下灭菌处理。准备就绪后进入接种室。注意：第一，紫外线对人体有害，在紫光灯照射期间，人不能停留在接种室内，紫外线照射会使空气中产生刺激性气味的臭氧，将紫光灯关闭并开启风幕一段时间后，实验人员方可进入；第二，紫外线对植物也有伤害，甚至诱导植物发生变异，如果此时植物材料已放入超净工作台，应将植物遮盖。

2.4 其他环節

操作工具：操作工具插在电子加热灭菌器（280 ℃）中进行灭菌。注意：第一，灭菌器的温度达到280 ℃以上才可达到对操作工具的灭菌效果；第二，因为操作工具是插在灭菌器中，因此其尾部还应用酒精棉仔细擦拭；第三，灭菌器一直放于超净工作台中，所以擦拭操作台时也应将灭菌器擦拭干净。

操作者：第一，穿经消毒的医用白大褂进入接种室；第二，穿拖鞋进入接种室；第三，佩戴医用无菌手套及口罩（手套可再用酒精擦拭几遍）。注意：白大褂和拖鞋使用前要在接种室用紫外线灭菌处理。

3 效果反馈

按照以上方案进行了芦荟组织培养实验，接种几天后进行观察，发现了被污染的瓶数明显减少了许多。这说明以上消毒灭菌的方案有一定的效果，但又出现了一些其他问题，如有些植物组织出现了死亡现象，原因可能是消毒过度。因此，消毒灭菌的方法还需要继续探索。

后记：在组培实验中，不仅消毒灭菌过程要小心谨慎，其他环节也同样如此。组培的周期很长，植物组织过了消毒这一关，也只是迈出了一小步，它的生长历程还需要更加精心的呵护。

指导教师评价：该同学在本实验小组研究杂菌污染因素的基础上，总结了组培实验室组培实验过程中消毒灭菌的方法。本文以牡丹江市第一高级中学组培室现有条件为背景，总结内容科学、严谨，方法实用，值得借鉴，特别适合本校组培室使用。该同学热爱学习，热爱组培实验，理论知识扎实、组培操作熟练、实验研究的热情高、动手能力强，善于总结经验。希望该同学能始终保持这种热情，也希望通过高中阶段的组培实验，对该同学将来个人发展能有所帮助。

（责任编辑：赵中正）