甜高粱（辽甜系列）再生体系建立与比较

刘玲利 李丛 樊金娟 朱延姝 崔震海 阮燕晔 宋波 郭志有

摘 要 建立了辽宁省能源专用甜高粱再生体系，筛选适合组织培养的辽甜系列品种，为遗传转化奠定基础。以辽甜系列甜高粱芽基部为外植体，在添加不同激素浓度的MS培养基上诱导愈伤组织，进而获得再生植株。辽甜4号和辽甜7号在添加500 mg/L水解酪蛋白和3 mg/L 2，4-D的MS培养基上能够诱导出生长状态良好的愈伤组织，愈伤组织诱导率达到92%和89%，辽甜4号愈伤组织分化能力比较强，在含有1 mg/L IAA和0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上分化率为76%；辽甜1号和辽甜5号出愈率相对较低，愈伤组织状态差，再生能力较弱。结果表明，能源用甜高粱辽甜系列品种中，辽甜4号更适用于组织培养和遗传转化。

关键词 甜高粱；愈伤组织；成熟种子；芽基部；再生体系

中图分类号：S566.5 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.32.060

甜高粱[Sorghum bicolor（L）.Moench]是C4作物中光合作用效率较高作物之一，生长迅速、糖分积累快、生物学产量高，具有抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱和乙醇转化率高等优点，被认为是最具开发潜力的能源作物之一[1]。然而甜高粱种质资源的匮乏，尤其抗倒伏、含糖量高的品种资源缺乏，传统的常规育种己不能满足人们对高能作物甜高粱的需求，分子育种能方便快捷的将所需的优良基因转入作物，进而获得性状优良的作物品种[2]。建立方便、稳定、高效的再生体系和遗传转化体系，是分子育种的基础。甜高粱是公认的再生体系较难的一种作物，大量研究结果表明，高粱愈伤组织的诱导和再生，受到诸多因素的影响。不同品种的选择、外植体的选择、培养基成分、外源激素的配比等都是影响高粱组织培养成功的关键因素。以往的研究中，甜高粱的组培多以幼胚、幼穗为外植体，但获取幼胚和幼穗费时、费力，同时受季节、地域的限制，难以保证稳定充足的外植体供应。而来源于成熟种子的外植体，如成熟种子、成熟胚、芽顶端分生组织等可以保证外植体的稳定供给。辽宁省农业科学院高粱研究所育成的能源专用甜高粱辽甜系列品种，具有优质、高产、多抗、广适等特点。本研究以能源专用甜高粱（辽甜系列品种）成熟种子为材料，选取成熟种子萌发后嫩芽组织的膨大部分为外植体，通过调整培養基激素浓度，筛选出最佳诱导、分化培养基，减轻褐化及水渍化问题；比较不同辽甜品种愈伤组织的诱导，分化及再生能力，筛选适宜组织培养的品种，为后续基因工程研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选用的试验材料为辽甜系列品种：辽甜1号、4号、6号和辽甜7号，由辽宁省农业科学院高粱研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 芽基部膨大组织的分离

将甜高粱种子用75%的乙醇灭菌1 min，然后用0.1%的升汞灭菌15 min，最后用无菌水洗涤6～7次，用无菌滤纸将种子表面水分吸干。将灭菌后的种子胚面朝下，接种于MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+2，4-D（2.0、3.0和4.0 mg/L）的诱导培养基中，（25±2）℃黑暗条件下培养3～7 d。选择芽基部膨大的正常种子，无菌条件下切取带有种子的膨大部分转移到继代培养基中继续培养，并统计不同品种萌发种子膨大率。

1.2.2 继代培养

培养5～7 d后，根据膨大部分愈伤组织形成情况，将生长良好的愈伤组织转移到MS+500 mg/L酸水解酪蛋白+3.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT的继代培养基上，（25±2）℃黑暗条件下培养28 d。

1.2.3 植株再生

将生长良好的愈伤组织接种于分化培养基（MS+1 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA）上培养30 d，再将芽转入生根培养基（MS+3 mg/L IBA）上，培养条件为（25±2）℃，每天16 h光照，光照强度为35 μmol/（m2·s）。

1.3 试验数据的统计分析

初始分生组织膨大率=（接种一周后膨大的分生组织块数目/接种的外植体数目）×100%；

愈伤组织诱导率=（接种四周后愈伤组织数目/接种的外植体数目）×100%；

愈伤组织分化率=（诱导出的丛生芽块数目/转接的膨大分生组织块数目）×100%。

2 结果与分析

2.1 芽基部膨大率及愈伤组织的诱导

将无菌的成熟的种子置于诱导培养基上，黑暗培养4～5 d后，芽基部均出现膨大现象。四个品种在2，4-D浓度为3.0 mg/L的诱导培养基中膨大组织的生长状态好于其他诱导培养基。如图1所示，辽甜4号和辽甜7号芽基部膨大率较高，分别为100%和98%，并且生长状态较好，出现愈伤组织；辽甜1号和辽甜5号芽基部膨大率相对较低，分别为84%和88%，并且膨大组织部分出现褐化现象，生长状态较差。

2.2 愈伤组织的继代

将生长良好的愈伤组织转移到含有低浓度KT的继代培养基上，继代时需将诱导时留着的种子部分切除，减少褐化，每2周继代一次，共继代2次，继代过程中愈伤组织形成率有明显的差异。如图2所示，辽甜4号和辽甜7号愈伤组织生长良好，体积明显增大，且愈伤组织结构致密，颜色呈淡黄色，愈伤组织最终诱导率分别为92%和89%；辽甜1号和辽甜5号愈伤组织最终诱导率分别为36%和24%，并且辽甜1号愈伤组织质地坚硬生长缓慢，而辽甜5号愈伤组织出现了水渍化和褐化问题。

2.3 再生植株的形成

将最终得到的愈伤组织转移到分化培养基上，5～6 d后愈伤组织表面出现绿色，1～2周后愈伤组织表面出现绿色芽点，3～4周后生长出不定芽。辽甜4号和辽甜7号最终分化率分别为76%和48%，而辽甜1号和辽甜5号分别为12%和9%。將不定芽转移至生根培养基中，4～6周后得到完整植株。

3 讨论

3.1 外植体的选择与处理

甜高粱再生體系的建立中，外植体的选择与处理是诱导初期的关键步骤。本研究选用成熟种子，取材方便，不受时空限制。待其芽长到2 cm左右时（约4～5 d），芽基部渐渐出现膨大，将其芽轴及芽尖切除，并保留膨大部分和胚乳部分3～5 d，待芽基部愈伤组织稳定形成后，再将胚乳部分切除。此方法使胚性愈傷组织形成率提高了17%，但胚乳部分也不能长时间保留，营养耗尽后，颜色加深，出现干瘪现象，此时要及时去除。

对比发现，直接切除胚乳部分的外植体，极易出现水渍状，最终褐化。同时，若种子胚乳部分与膨大部分接触点出现了黑色褐化，要及时将种子胚乳部分去除，减少褐化。

3.2 组织培养过程中的褐化问题

研究表明，若离体材料较小，极易出现褐化，外植体受伤害程度如切口面积过大也会加重褐变程度。本研究对外植体的处理中，胚乳部分的切除与否也会影响褐化程度，导致这种现象的原因除了离体材料大小及切口面积外，也可能因为胚乳里面含有相应的生长激素或酶类，减少了褐化，有利于愈伤组织的形成，对新生组织有一定的保护作用。在继代时发现有些愈伤组织出现褐化，但未接触培养基的愈伤组织正常生长，下面部分出现了褐化现象，可能是组织的一种自我保护，确保了上面的愈伤组织正常生长，有些愈伤组织出现水渍状，这种愈伤组织不再具有分化能力，可通过提高琼脂的浓度来改善。

3.3 不同品种间组织培养与再生能力比较

不同品种的甜高粱在组织培养及再生能力方面存在差异。四个辽甜品种中，辽甜4号的愈伤组织诱导效率高、生长较快、结构紧密、颜色淡黄，且辽甜4号无论在初始分生组织膨大率、愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率上都高于其他辽甜品种。这可能是由于不同品种的基因型不同。

4 结论

本研究以能源专用甜高粱辽甜系列品种成熟种子为材料，建立并改进了甜高粱再生体系，发现诱导培养基中种子发芽2 d后出现膨大，芽长达到2 cm左右时，剪掉其余芽组织，有利于胚性愈伤组织的形成，在愈伤组织稳定形成后，去除种子的胚乳部分，可以减轻褐化和水渍化；同时筛选适宜组织培养的辽甜系列品种，发现辽甜4号品种具有更高的再生能力，更易于组织培养和遗传转化。

参考文献

[1]汪家灼.甜高粱杂交种——新的生物质能源[J].内蒙古农业科学，2007（3）：75-76.

[2]葛玉红.甜高粱再生体系的优化研究[D].广西：广西大学农学院，2011.

（责任编辑：刘昀）