花生ABI3基因的克隆、序列分析及表达载体构建

王云云 孙全喜 王秀贞 唐月异 吴琪 张青云 曹广英 祁雪 张君 王传堂

摘要：脱落酸（ABA）作为植物体内的一种重要激素，参与植物多个生长发育过程。ABI3是ABA信号转导途径中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从花生成熟种子中克隆到ABI3的同源基因AhABI3。预测该基因开放阅读框为2313 bp，编码770个氨基酸。同源比较发现AhABI3与拟南芥、鹰嘴豆等的ABI3具有较高的相似性；进化分析表明AhABI3与鹰嘴豆ABI3亲缘关系最近。本研究还成功构建了AhABI3的过量表达载体pCambia2300EC-AhABI3，为进一步研究其功能奠定了基础。

关键词：花生；AhABI3；进化树分析；氨基酸比对；植物表达载体构建

中图分类号：S565.201

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0001-06

花生（Arachis hypogaea L.）是一种豆科植物，其种植面积排在稻谷、小麦、玉米、大豆、油菜和甘薯之后，列第七位，在油料作物中，其种植面积仅次于油菜。花生作为我国重要的油料和经济作物，在油料生产和国际贸易中占有举足轻重的地位，与油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的单产、总产量和出口量均居首位。

脱落酸（ABA）作为植物体内的一种重要激素，参与植物多个生长发育过程，如抑制种子萌发、促进休眠、抑制生长、促进叶片衰老脱落等。ABI3基因是ABA信号转导途径中的关键基因，在调节种子成熟、萌发等生长过程中起着重要作用。

拟南芥ABI3在种子成熟过程中起着主要调节作用。玉米VP1基因与拟南芥ABI3基因在氨基酸序列水平上有较高的相似性，它能使种子早熟，抑制胚胎和糊粉层中花青素积累。ABI3/VP1的同源基因也已在其他植物中发现，如水稻、菜豆、燕麦、胡萝卜、白杨等，这些基因编码的蛋白序列的高度保守性表明该转录因子家族在调控开花植物的胚成熟过程中发挥着极其重要的作用。Giraudat等对ABI3和VP1蛋白序列的分析发现了3个高度保守区域，从氨基端分别命名为B1、B2和B3。从玉米VPI中分离出其B3结构域，发现它在体外可以与C1基因启动子上的Sph基序（含有RY元件）特异性地结合。郭晓芳等通过Northern杂交技术检测到ABI3同源基因在花生种子的子叶和胚中表达，但是没有对该基因进行克隆。

本研究从花生“X-166”成熟种子中克隆到AB13的同源基因AhABI3，经同源比对和进化树分析，AhABI3与来自其它物种的ABI3有较高的同源性；构建了AhABI3的过量表达载体pCam-bia2300EC-AhABI3，旨在研究该基因在花生中的作用。

1 材料与方法

1.1 植物材料及载体

试验所用“X-166”花生种子由山东省花生研究所提供；植物表达载体pCambia2300EC（添加了35S启动子以及Tnos终止子的pCambia2300载体）由山东农业大学元宝秀教授馈赠。

1.2 试验方法

1.2.1 AhAB13基因序列的获得及PCR扩增 利用拟南芥ABI3 mRNA序列（GenBank登录号：NC_003074.8）在花生基因组数据库（http：//www.peanutbase.org）中进行BLAST，获得可能的花生AhABI3序列（PU48P.1）。根据预测基因的开放阅读框（ORF），用DNAClub设计引物F1、R1（表1）。

提取花生种子总RNA，用ReverAid FirstStrand cDNA Svnthesis Kit（Fermentas）试剂盒进行反转录获得单链cDNA，利用引物F1、R1对该基因的开放阅读框进行扩增。PCR反应体系：5×HF Buffer 10 μL， dNTP Mix（10 mmol/L）2μL，引物F1 2μL，引物R1 2μL，DMS0 0.6μL，高保真酶Phusion（New England Labs）0.2μL，模板1μL，ddH₂O32.2μL。PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，循环30次；72℃后延伸10min。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR产物。将回收产物与pEASY-Blunt simple载体（北京全式金）连接、热激法转化大肠杆菌DH5a（北京全式金），取阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序，将测序正确的克隆命名为pEASY-AhABI3-1。

1.2.2 AhABI3基因序列和氨基酸序列分析 基因开放阅读框、氨基酸序列比对由DNAMAN序列分析软件（Lvnnon Biosoft）完成。

1.2.3 系统发育树的构建将AhABI3编码的氨基酸序列与来自其它物种的ABI3氨基酸序列进行比对分析，并使用DNAMAN软件构建系统发育树。

1.2.4 植物过量表达载体的构建 参照质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）说明步骤，提取pEASY-AhABI3-1和pCambia2300EC质粒。用DNAClub设计含Kpn I（Fermentas）和Sac I（Fermentas）酶切位点的引物F2、R2（表1），对pEASY-AhABI3-1质粒稀释物进行PCR扩增。得到的片段连接克隆载体pEASY-bluntsimple后，得到质粒pEASY-AhAB13-2，利用Kpn I和Sac 1分别对其和植物表达载体pCam-bia2300EC进行双酶切，回收目的片段，使用连接酶Solution I（大连宝生物）16℃过夜连接，转化大肠杆菌感受态DH5a，挑取单菌落进行PCR和酶切鉴定并测序，获得带有AhABI3的植物表达载体pCambia2300EC-AhABI3.

2 结果与分析

2.1 花生总RNA的提取

将提取的花生种子RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测（图1），可见28S和18S条带清晰完整，表明所提RNA质量较好，可用于下一步试验。

2.2 AhABI3基因的克隆

以RNA反转录所得cDNA为模板，利用设计的引物F1、R1进行PCR扩增，获得大小约为2300 bp的片段（图2），与预期结果一致。将测序结果利用DNAMAN软件分析得到长度为2313bp的ORF，编码770个氨基酸（图3）。

2.3 AhABI3氨基酸序列分析

将推导的AhABI3氨基酸序列与来自其它5个物种的ABI3氨基酸序列进行比对，并构建系统发育树。序列比对结果显示AhABI3与鹰嘴豆ABI3序列的同源度较高，与拟南芥等其它物种的ABI3存在一定的同源性，其中，B3结构域有很高的相似性（图4）。由此推断，AhABI3应为ABI3的同源基因。系统发育树结果显示AhABI3与鹰嘴豆ABI3亲缘关系较近（图5）。

2.4 AhABI3基因植物表达载体构建

对带有目的基因片段的克隆载体pEASY-AhABI3-2和植物表达载体pCambia2300EC同时用Kpn I和Sac I进行双酶切，酶切结果见图6，回收目的片段以及载体片段，连接后，转化大肠杆菌DH5a，经菌液PCR后，挑取阳性克隆测序，测序结果表明AhABI3片段已准确插入到植物表达载体pCambia2300EC上，载体结构见图7。

3 讨论

种子休眠的建立与维持与脱落酸ABA密切相关。在野生型拟南芥种子中，ABA的累积诱导种子进入休眠，并维持休眠状态。ABA不敏感突变体（abil和abi2）种子表现为轻度休眠，在萌发过程中对ABA抑制萌发的敏感性降低；而ABA敏感性增强突变体表现为抑制种子萌发所需ABA量的降低。这表明对于维持种子的休眠性，种子中ABA含量以及对ABA的敏感性均起着重要作用。

ABA生物合成基因的过量表达会使种子中ABA含量增加，从而促进种子休眠或延迟萌发。陈静等研究显示，休眠花生种子在吸胀过程中，为了维持种子休眠性，ABA合成关键基因AhNCED2的表达量增加，吸胀18h时达到峰值，随即开始下降。ABI3转录因子在ABA信号转导途径中是必不可少的，这暗示AhABI3基因可能与花生种子休眠有关。本研究克隆得到AhABI3基因，经生物信息学分析，认为其是ABI3基因的同源基因，并成功构建了植物过表达载体pCambia2300EC-AhABI3，为进一步研究AhABI3基因的功能奠定了基础。